Parameterdetails

Parametername: Notch1 c.7544_7545 del CT Genotypisierung

Version: 1 Gültig ab 29.11.2019

Beschreibung* Nachweis der Notch1 c.7544_7545 CT-Deletion in isolierten mononukleären Zellen (Vollblut, Knochenmarkaspirat) mittels ARMS-PCR

Ziel und Zweck der Untersuchung Rossi et al. zeigten im Jar 2012, dass bei ca. 11% von Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) eine somatische Mutation im Notch1 Gen auftritt. Die am häufigsten hierbei auftretende Veränderung ist eine Deletion der Basen CT in der PEST-Domäne des Gens. Eine Studie, die an CLL-Patienten in Salamanca, Spanien, durchgeführt wurde, bestätigte, dass die CLL-assoziierte Mutation des Notch1-Gens in der PEST Domäne lokalisiert ist [2]. Diese CT Deletion im Notch1 Gen hat einen negativen Einfluss auf den behandlungsfreien Zeitraum (Time to Treatment, TTT), weshalb es bei derzeitiger Datenlage sehr wichtig scheint, diese Mutation so früh als möglich zu detektieren, damit bereits frühzeitig mit entsprechenden Therapien begonnen werden kann. CLL- Patienten mit einem mutierten Notch1 Gen haben eine um die Hälfte kürzere TTT im Vergleich zu CLL Patienten mit unmutiertem Notch1 Gen. Da die Zahl mutierter Allele stetig mit Fortschreiten der Krankheit ansteigt, kann der Nachweis der Notch1 CT-Deletion auch als Verlaufsindikator bei CLL Patienten dienen. Die rezente Literatur liefert eindeutige und signifikante Hinweise, dass Notch1 Mutationen neben der Rolle bei der T-ALL eine große Bedeutung bei der Diagnostik der chronisch lymphatischen Leukämie zukommt. Die Bedeutung liegt nicht nur in der Prognoseabschätzung der CLL (z.B. kurzes Intervall bis zur Behandlungsbedürftigkeit, hohes Risiko einer Richter-Transformation) sondern auch in der Verlaufsbeurteilung (Therapieansprechen) der Erkrankung.

Prinzip des Verfahrens Amplifikation der aus mononukleären Zellen isolierten DNA mittels ARMS-PCR (Amplification-Refractory Mutation System).
Die im ZIMCL zum Nachweis eingesetzte ARMS-PCR ist eine sensitive Methode, um Einzelbasenänderungen bzw. kleine Deletionen zu detektieren. Hierzu werden im beschriebenen Assay zum Nachweis der somatischen CT-Deletion zwei verschiedene Forward Primer (Forward MUT, Forward WT) und ein gemeinsamer Reverse Primer verwendet. Liegt eine Deletion vor, entstehen zwei PCR Produkte deutlich unterschiedlicher Längen. Die Reaktionsbedingungen wurden so gewählt und validiert, dass schon eine oft geringe Anzahl mutierter Allele ("mutational allelic burden") bei CLL-Patienten im Frühstadium mit einer Sensitivität entdeckt wird, die deutlich (ca. 10-fach) unterhalb der Nachweisgrenze der klassischen Sanger-Sequenzierung liegt. Dies ist von besonderer Bedeutung, da in Studien gezeigt wurde, dass bei bis zu 30% der CLL-Patienten die Notch1 Mutation mit klassischer Sanger-Sequenzierung nicht entdeckt werden kann [1,2].
Die ARMS-PCR wird als eine klassische Endpunkt-PCR mit dem beschriebenen Primer-Triple durchgeführt, die entstehenden PCR-Produkte entweder mittels Kapillarelektrophorese oder durch elektro-phoretische Auftrennung in einem klassischen Gel untersucht.

Literatur [1] Rossi D et al. Mutations of Notch1 are an independent predictor of survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2012;119: 521-529.
[2] Weissmann S et al. Prognostic impact and landscape of Notch1 mutations in chronic lymphocytic leukemia (CLL): a study on 852 patients. Leukemia 2013, in press
[3] Blombery et al. Molecular lesions in B-cell lymphoproliferative disorders: recent contributions from studies utilizing high-throughput sequencing techniques. Leukemia & Lymphoma 2013, DOI: 10.3109/10428194.2013.792112
[4] Gunnarsson et al. Exploring the genetic landscape in chronic lymphocytic leukemia using high-resolution technologies. Leukemia & Lymphoma 2013;54(8):1583–1590
[5] Rosenquis et al. Prognostic markers and their clinical applicability in chronic lymphocytic leukemia: where do we stand? Leukemia & Lymphoma 2013, DOI: 10.3109/10428194.2013.783913
[6] Schnaiter et al. NOTCH1, SF3B1, and TP53 mutations in fludarabine-refractory CLL patients treated with alemtuzumab: results from the CLL2H trial of the GCLLSG. Blood 2013, doi:10.1182/blood-2013-03-488197

Ergebniseinheit

Einheiten(sonstige) qualitative Analyse (Notch1 c.7544_7545 del CT nachgewiesen/nicht nachgewiesen)

Synonyme NOTCH1 C.7544_7545 DEL CT
Notch
p.Pro2511Argfs*4

Analysenfrequenz nach Anforderung

Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage) 12 Stunden

Spezimen
(Plasma, Serum, Harn) EDTA-Vollblut, Knochenmarkaspirat (EDTA, Heparin)

Sammelperiode nicht zutreffend

Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation) 3 ml

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe K-EDTA Monovette

Spezielle Präanalytik - Probentransport Probenanlieferung bei 2-8°C, nicht frieren, nicht aliquotieren. Keine Annahme von Sekundärröhrchen!

Messbereich nicht zutreffend

Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie) Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials

Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch) nicht zutreffend

Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR in-House Leistungsbewertung

Ausdruck gültig am 21.09.2020

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