Beschreibung*
Qualitativer Nachweis Heparin- bzw. Protaminsulfat-abhängiger Antikörper vom IgG-Isotyp in humanem Plasma mittels ELISA
Ziel und Zweck der Untersuchung
Eine Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) vom immunallergischen Typ (Typ II) kann während einer Heparinbehandlung auftreten und ist eine der wesentlichen Komplikationen dieser Therapie. Sie beruht auf der Bildung von Antikörpern, die gegen Protein:Heparin-Komplexe gerichtet sind. Solche Heparin-abhängigen Antikörper sind in der Lage, Plättchen zu aktivieren, was sowohl eine Thrombozytopenie als auch thrombotische Ereignisse zur Folge haben kann. Neben Antikörpern gegen Heparin im Komplex mit Plättchenfaktor 4 (PF4) wurden, wenn auch seltener, Antikörper gegen Heparin im Komplex mit anderen Chemokinen wie Interleukin-8 (IL-8) und Neutrophil-Activating Peptide (NAP2) beschrieben. Diese multimolekularen Komplexe können antigen wirksam werden und die Bildung Heparin-abhängiger Antikörper induzieren. Im Wesentlichen ist eine HIT Typ II auf Heparin-abhängige Antikörper vom IgG-Isotyp zurückzuführen, während Antikörper der IgA- und IgM-Isotypen meist asymptomatisch sind. Um das Risiko für klinische Komplikationen im Rahmen einer HIT Typ II zu bestimmen, ist jedoch ein Screening nach allen drei Isotypen hilfreich. Die Vielfalt an Heparin-abhängigen Antikörpern, die für die Entstehung einer HIT Typ II verantwortlich sein können, erklärt eventuelle Diskrepanzen zwischen einem klinischen Bild und den Ergebnissen diagnostischer Teste nur teilweise. Dieser Sachverhalt wird durch das Auftreten Protaminsulfat-abhängiger Antikörper verkompliziert. Diese gegen Protaminsulfat:Heparin-Komplexe gerichteten Antikörper sind in der Lage, ein der HIT Typ II nahezu identisches Krankheitsbild (Pseudo-HIT) hervorzurufen, können aber durch herkömmliche immunologische und funktionelle Teste nicht nachgewiesen werden. Protaminsulfat wird zur Neutralisation von Heparin, z.B. nach Herzoperationen, eingesetzt. Ein erhöhtes Risiko für eine Pseudo-HIT besteht dann, wenn Protaminsulfat-abhängige Antikörper bereits vor der Behandlung mit Protaminsulfat vorhanden sind, z.B. bei wiederholten Herzoperationen, aber vermutlich auch bei Diabetikern unter Insulintherapie, zumal Insulinpräparate Protaminsulfat als Stabilisator enthalten. Nach aktuellem Erkenntnisstand wird nur Protaminsulfat-abhängigen Antikörpern vom IgG-Isotyp klinische Relevanz beigemessen.
Prinzip des Verfahrens
ELISA; Die verdünnte Probe (humanes Plasma) wird zusammen mit einem Thrombozytenlysat in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert, die mit Protaminsulfat und einem Überschuss an unfraktioniertem Heparin beschichtet sind. Unter Nachahmung der Abläufe, die sich in vivo abspielen, komplexieren in der Probe bzw. im Plättchenlysat enthaltene Chemokine wie Plättchenfaktor 4 (PF4) mit diesem Heparin. Diese spezielle Beschichtung aus Protaminsulfat und dynamischen PF4:Heparin-Komplexen erlaubt die Bindung von in der Probe vorhandenen Heparin- bzw. Protaminsulfat-abhängigen Antikörpern. Nach einem ersten Waschschritt erfolgt die Zugabe eines Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelten polyklonalen Antikörpers, der für das humane Fc-gamma-Fragment und folglich für humane Antikörper vom IgG-Isotyp spezifisch ist. Nach einem zweiten Waschschritt wird das Peroxidasesubstrat, 3,3‘,5,5‘-Tetramethyl-benzidin (TMB), in Gegenwart von Wasserstoff-peroxid (H2O2) zugegeben. Unter diesen Bedingungen färbt sich TMB blau und schlägt beim Stoppen der Reaktion mit Schwefelsäure nach gelb um. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zum Titer Heparin- bzw. Protamin-sulfat-abhängiger Antikörper vom IgG-Isotyp in der Probe.
Literatur
- Juhl D et al. Eur J Haematol 2006;75:420-426 - Schenk S et al. J Thromb Haemost 2007; 5:235-241 - Greinacher et al. J Thromb Haemost 2007; 5:1666-1673 - Amiral et al. Presence of autoantibodies to interleukin-8 or neutrophil-activating peptide-2 in patients with heparin-associated thrombocytopenia. Blood 1996; 78:449. - Amiral et al. Association of protamine sulfate antibodies with ‘Pseudo-HIT’ in heparin-treated patients. Haemostaseologie 2009; PP4.4-9:A65. - Bakchoul T. et al. Anti-protamine-heparin antibodies: incidence, clinical relevance and pathogenesis. Blood 2013; - Singla A. et al. Protamine-induced immune thrombocytopenia. Transfusion 2013; - Rundschreiben ZIMCL
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
Qualitatives Testverfahren (positiv/schwach positiv/negativ)
Synonyme
HIT-AK, HIT2-AK HIT HIT-Antiköprer Pseudo-HIT Protamin Antikörper Protaminsulfat Antikörper Antikörper gegen Protaminsulfat PIT
Analysenfrequenz
Bei Bedarf; bei Eintreffen der Probe an Werktagen bis 10:00Uhr erfolgt die Abarbeitung am gleichen Tag. Bei Eintreffen nach 10:00 Uhr als auch bei Einsendung an Samstagen, Sonn- oder Feiertagen erfolgt die Abarbeitung am nächsten Werktag.
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24 Stunden
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
Citratplasma
Sammelperiode
Nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
1ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
Citrat (3.13% 0.106 mol/L Natriumcitrat) Monovette
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Rohrpostversand möglich (innerhalb von 2h nach Abnahme); Bei Einsendung von Citratplasma: Zentrifugation des antikoagulierten Vollblutes für 20 min. bei 2500g erforderlich. Bei Eintreffen der Probe im Labor innerhalb von 20h ist ein Transport bei 2-8°C möglich, andernfalls muss das Plasma auf Trockeneis transportiert werden.
Messbereich
Qualitative Analyse (positiv/schwach positiv/negativ)
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
durch Heparin > 1U/ml
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
Protaminsulfat, Interleukin-8 (IL-8), Neutrophil-Activating Peptide (NAP2)
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
CE-IVD
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