Beschreibung*
Genotypisierung von Cytochrom P450 Isoenzym 3A4 *22 aus Vollblut mittels qPCR.
Ziel und Zweck der Untersuchung
CYP3A5 und dessen Isoenzym 3A4 weisen eine große strukturelle Verwandtschaft sowie ein ähnliches Substratspektrum auf und sind zwei der wichtigsten Enzyme der Cytochrom P450-Enzymfamilie. Sie sind an der Verstoffwechslung einer Vielzahl von endogenen und exogenen Substanzen (endogene Steroide, Toxine, Immunsuppressiva wie Tacrolimus oder Cyclosporin uva) beteiligt. Polymorphismen im CYP3A5-oder -3A4 Gen können zu einer erniedrigten Enzymaktivität und Substrat-Metabolisierung führen und in der Folge eine Dosisanpassung notwendig machen. Der CYP3A4 Wildtyp, welcher zu einer normalen Enzymaktivität führt, kommt bei Kaukasiern mit einer Prävalenz von 90-95% vor. Ca. 3-5% der Kaukasier weisen jedoch den CYP3A4*22-Polymorphismus (C20493T) auf. Diese Variante geht in mehreren Studien mit einem reduzierten Tacrolimus-Metabolismus bzw. mit erhöhten Tacrolimus-Wirkstoffspiegeln einher. Die CYP3A5/A4-Genotypisierung ist indiziert bei Patienten vor Beginn einer Therapie mit Tacrolimus oder CyclosporinA zur schnelleren Erreichung eines stabilen Wirkstoff-Spiegels sowie zur Vermeidung einer Überdosierung (Risiko der Nephrotoxizität) oder Unterdosierung (Risiko der akuten Transplantatabstoßung). Außerdem kann sie Aufschluss über Patienten mit unerwünschten Wirkungen unter Tacrolimus-Therapie geben.
Prinzip des Verfahrens
qPCR, allelische Diskrimminierung Die Genotypisierung erfolgt nach dem Prinzip der allelischen Diskriminierung mittels Realtime PCR. Es erfolgt eine PCR mit einem spezifischen Primer-Paar sowie unterschiedlich markierter Sonden für den Wildtyp und das mutierte Allel. Die Sequenzen der beiden Sonden unterscheiden sich exakt in dem Nucleotid das den SNP charakterisiert. Es werden sogenannte Hydrolyse-Sonden verwendet. Ein Oligonucleotid mit einem Reporter und einem Quencher lagert sich dabei sequenzspezifisch an den Einzelstrang an. Sobald die Polymerase ihre Aktivität aufnimmt, wird der Quencher von der Sonde entfernt und die Reporterfluoreszenz freigesetzt.
Literatur
• van Schaik et al. “CYP3A5 variant allele frequencies in Dutch Caucasians.” Clin Chem. 2002 Oct;48(10):1668-71. • H de jonge “In Vivo CYP3A4 Activity, CYP3A5 Genotype, and Hematocrit Predict Tracolimus Dose Requirements and Clearance in Renal Transplant Patients” Clinical Pharmacology & Therapeutiks, advance online publication 08/2012 doi:10.1038/clpt.2012.109 • D. Hesselink et al. “Genetic Polymorphism of the CYP3A4 / A5 / MDR-1 genes and pharmakokinetics oft he calcineurin inhibitor cyclosporin and tacrolimus“ Clinical Pharmacology & Therapeutiks, 2003, 0009-9236 • J. Ekbal et al. „Pharmacogenetics of immunosuppressive drugs: prospect of individual therapy for transplant patients.” Pharmacogenomics (2008), 9(5), 585-596 [2] L. ElensM R. R. Bouamar et al.; “A New Functional CYP3A4 Intron 6 Polymorphiosm Significantly Affects Tacrolimus Pharmacokinetics in Kidney Transplant Recipients” Clinical Chemistry 57:11, 1574-1583 (2011)
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
qualitative Analyse
Synonyme
Arzneimittelnebenwirkung CYP3A4 Genotypisierung Pharmakogenetik Tacrolimus Sirolimus Cyclosporin
Analysenfrequenz
1x wöchentlich
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
72 Stunden
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
1 ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Für die CYP3A4-Genotypisierung ist derzeit keine Einverständniserklärung erforderlich. Probenanlieferung bei 2-8°C, nicht frieren, nicht aliquotieren. Keine Annahme von Sekundärröhrchen! Laut Beschluss der österreichischen Genttechnikkommission vom 4.12.2009 gilt für pharmakogenetische Untersuchungen folgende Regelung: Sollte ein im Zuge einer pharmakogenetischen Untersuchung analysierter Polymorphismus auch Aussagen i.S.d. §65 Abs.1 Z3 und 4 GTG über die Veranlagung für eine möglicherweise künftig ausbrechende genetisch bedingte Erkrankung zulassen, so ist die Untersuchung dieses Polymorphismus antragspflichtig i.S.d. §68 Abs.2 GTG.
Messbereich
*1/*1, *1/*22, *22/*22
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
• Heparin als Antikoagulans • Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
in-House Leistungsbewertung
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