Beschreibung*
Sequenzanalyse der Fibrinogen Alpha, Beta und Gamma Gene mittels Kapillar-Sequenzierung der isolierten genomischen DNA
Ziel und Zweck der Untersuchung
Die molekulargenetische Abklärung bei Verdacht auf das Vorliegen einer Dys-, Hypo- oder Afibrinogenämie ist der letzte Schritt in der Stufendiagnostik der Fibrinogen-Störungen und ermöglicht bei Mutations-Nachweis die definitive Diagnose bzw. Subtypisierung einer Dys-, Hypo- oder Afibrinogenämie. Schätzungen zufolge tritt eine Afibrinogenämie mit einer Häufigkeit von 1:10E6 auf. Die Hypo- und Dysfibrinogenämien sind mit geschätzten Inzidenzen von 1:100.000–1:500.000 häufiger. Drei unterschiedliche Gene, die auf Chromosom 4q28 einen Gen-Cluster bilden, kodieren für die drei Proteinketten des Fibrinogenmoleküls. Die im ZIMCL angewandte Untersuchungsmethode umfasst die in der Literatur als Mutations-Hotspots beschriebenen Exons 1, 2, 3, 4 und 5 des FGA-Gens, die Exons 2 und 3 des FGB-Gens sowie die Exons 8, 9 und 10 des FGG-Gens. Mutationen in jedem der drei Gene können die Fibrinogensynthese stören, wobei sich die bekannten Mutationen relativ gleichmäßig auf alle drei Gene verteilen. Das Spektrum der Mutationen ist heterogen; eine bevorzugte und besonders häufig vorkommende Mutation ist nicht beschrieben. Während einige Formen des Fibrinogenmangels zu einem erhöhten Thromboserisiko führen, sind auch Mutationen, die paradoxerweise mit erhöhter Blutungsneigung einhergehen, bekannt.
Prinzip des Verfahrens
Während der Sequenzier (Cycle Sequencing)-Reaktion führt der Einbau eines Fluoreszenz-markierten dd(didesoxy)NTPs zum Abbruch der Polymerisationsreaktion. Durch diese Kettenabbrüche entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die am Ende jeweils mit einem von vier Fluoreszenzfarbstoffen (je nach eingebauter Base am Strangende) markiert sind. Die entstehenden Kettenabbruchprodukte werden mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz angeregt. Das Chromatogramm (die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen) gibt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder.
Literatur
[1.] De Moerloose et al. Congenital fibrinogen disorders. Semin Thromb Hemost. 2009 Jun;35(4):356-66 [2.] Mosesson et al. Dysfibrinogenemia and thrombosis. Semin Thromb Hemost. 1999;25(3):311-9. [3.] Neerman-Arbez et al. Fibrinogen gene mutations accounting for congenital afibrinogenemia. Ann N Y Acad Sci. 2001;936:496-508. [4.] Neerman-Arbez et al. Mutations in the fibrinogen aalpha gene account for the majority of cases of congenital afibrinogenemia. Blood. 2000 Jul 1;96(1):149-52. [5.] Neerman-Arbez et al. Mutations in the fibrinogen gene cluster accounting for congenital afibrinogenemia: an update and report of 10 novel mutations. Hum Mutat. 2007 Jun;28(6):540-53. [6.] Hill et al. Diagnosis, clinical features and molecular assessment of the dysfibrinogenaemias. Haemophilia. 2008 Sep;14(5):889-97. doi: 10.1111/j.1365-2516.2008.01795.x. Epub 2008 Jun 28. [7.] Ellard et al. Practice guidelines for Sanger Sequencing Analysis and Interpretation. CMGS 2009 [8.] Terasawa et al. Hypofibrinogenemia associated with a heterozygous missense mutation gamma153Cys to arg (Matsumoto IV): in vitro expression demonstrates defective secretion of the variant fibrinogen. Blood. 1999 Dec 15;94(12):4122-31.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
Qualitative Analyse; zu erwartende Ergebnisse: Nachweis / Kein Nachweis einer Mutation in heterozygoter Form / in homozygoter Form im Fibrinogen Alpha, Beta oder Gamma Gen.
Synonyme
Dysfibringenämie-Abklärung, Hypofibringenämie-Abklärung, Afibringenämie-Abklärung, Fibrinogenstörung-Abklärung, Fibrinogen-Sequenzierung.
Analysenfrequenz
b.B.
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
2ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
nicht zutreffend
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Laut österreichischem Gentechnikgesetz ist eine schriftliche Einverständniserklärung zur Durchführung der Genanalyse erforderlich. Probenanlieferung bei 2-8°C, nicht frieren, nicht aliquotieren. Keine Annahme von Sekundärröhrchen!
Messbereich
Qualitative Analyse; zu erwartende Ergebnisse: Nachweis / Kein Nachweis einer Mutation in heterozygoter Form / in homozygoter Form im Fibrinogen Alpha, Beta oder Gamma Gen.
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
•Heparin als Antikoagulans •Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
nicht zutreffend
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
in-House Leistungsbewertung
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