Beschreibung*
Nachweis der BRAF V600E Mutation in isolierten mononukleären Zellen (Vollblut, Knochenmarkaspirat) / ctDNA mittels ddPCR
Ziel und Zweck der Untersuchung
Der Nachweis der BRAF (Isoform B der Proteinkinase-Familie RAF = rapidly accelerated fibrosarcoma) V600E Mutation dient der differentialdiagnostischen Abgrenzung der klassischen Haarzell-Leukämie gegenüber der Haarzell-Leukämie Variante und anderen indolenten Non-Hodgkin Lymphomen sowie zur Verlaufskontrolle unter Therapie. Neben der Assoziation mit Haarzell-Leukämien wird die BRAF V600E Mutation auch bei Colonkarzinomen, bei nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen (NSCLC), bei serösen Ovarialkarzinomen, bei Melanomen und bei papillären Schilddrüsenkarzinomen als krankheitsauslösend beschrieben, indem sie zu einer erhöhten Kinase-Aktivität führen. Bei diesen Krankheiten ist der Nachweis der BRAF V600E Mutation auch aus zirkulierender Tumor-DNA (sog. Liquid Biopsy aus peripherem Blut) möglich. BRAF Mutationen an der Stelle V600 sind assoziiert mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber einer Therapie mit BRAF Inhibitoren (zB Vemurafenib) und daher auch von therapeutischem Interesse. Ein negatives Testergebnis schließt das Vorliegen anderer BRAF-Mutationen nicht aus.
Prinzip des Verfahrens
Das digital droplet PCR-System (ddPCR) beruht auf der Partitionierung eines konventionellen PCR-Ansatzes in bis zu 20.000 Einzelreaktionen (im ZIMCL verwendete Methode: Partitionierung mittels Wasser-Öl-Emulsion). Für gewöhnlich enthält man Partitionen, die eine oder mehrere Kopien der Ziel-DNA sowie Partitionen, die keine Ziel-DNA enthalten. Anschließend wird eine Endpunkt-PCR (z. B. mit Hydrolysesonden) und eine Detektion der Amplifikation für jedes Kompartiment durchgeführt, sodass sich ein positives (1) oder negatives (0) Signal für jede einzelne Partition ergibt. Diese 0/1-Antworten führten zu der Bezeichnung „digitale PCR“. Die Rohdaten werden dann mittels Poisson-Statistik analysiert und die absolute DNA-Ausgangskopienzahl in der Originalprobe bestimmt. Ein großer Vorteil der ddPCR liegt in der absoluten Quantifizierung von Zielgenen, d.h. eine Quantifizierung ohne Verwendung einer externen Kalibration, z.B. einer Standardkurve. Der zweite große Vorteil der ddPCR ist die Detektion von Mutationen mit geringem allelischen Anteil, die vor allem in der Krebsdiagnostik eine wichtige Rolle spielen. Bei der konventionellen qPCR-Analyse liegt das Hintergrundsignal (Kopienzahl) des Wildtyp-Allels oftmals deutlich über dem der Mutation, sodass eine Detektion der Mutation schwierig ist. Durch die Partitionierung bei der ddPCR wird das Hintergrundsignal des Wildtyps jedoch reduziert und die Mutation innerhalb der Partition aufkonzentriert. Der Nachweis von solchen raren Mutationen spielt v.a. in der MRD-Diagnostik (Minimal Residual Disease, Verlaufskontrollen bei hämatoonkologischen Erkrankungen) eine ausschlaggebende Rolle. In der ddPCR werden die gleichen Reagenzien und Arbeitsabläufe wie in den meisten Standard TaqMan –Hydrolyseprobe-basierenden PCR-Ansätzen verwendet. Beim Nachweis der BRAF V600E Mutation kommt die allelspezifische PCR-Technologie zum Einsatz, die einen empfindlichen, genauen und hoch reproduzierbaren Nachweis der SNPs ermöglicht. Nur bei einer perfekten Übereinstimmung zwischen Sonden und Target-DNA kommt es bei der Extension in der PCR zu einer Hydrolyse der Sonde und somit zur Detektion eines Fluoreszenzsignals.
Literatur
Tiacci et al. BRAF mutations in hairy-cell leukemia. N Engl J Med. 2011 Jun 16;364(24):2305-15. Blombery et al. Detection of BRAF mutations in patients with hairy cell leukemia and related lymphoproliferative disorders. Haematologica. 2012; 97(5)780-83. Arcaini et al. The BRAF V600E mutation in hairy cell leukemia and other mature B-cell neoplasms. Blood. 2012 119: 188-191. Simple genetic diagnosis of hairy cell leukemia by sensitive detection of the BRAF-V600E mutation. Blood. 2012 119: 192-195 Spindler et al. Quantitative cell-free DNA, KRAS, and BRAF mutations in plasma from patients with metastatic colorectal cancer during treatment with cetuximab and irinotecan. Clin Cancer Res. 2012 Feb 15;18(4):1177-85.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
Qualitative Analyse: BRAF V600E Mutation nachweisbar / nicht nachweisbar
Synonyme
BRAF BRAF V600E c.1799T>A p.Val600Glu
Analysenfrequenz
nach Bedarf
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24 h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut, Knochenmark
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
3 ml aus pB MNC, bei Bestimmung aus ctDNA: 10ml Paxgene Spezial-Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
Bei Bestimmung aus ctDNA: 10ml Paxgene Spezial-Monovette (keinesfalls geringeres Volumen!)
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Probenanlieferung von intern bei RT, von extern bei 2-8°C, nicht frieren!
Messbereich
BRAF V600E Mutation: nachweisbar/nicht nachweisbar
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
•Heparin als Antikoagulans kann die PCR stören •Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials •CAVE: Aufgrund des oft zellarmen Knochenmarks und der Faservermehrung bei Haarzellleukämien(Punctio sicca) kann es zu falsch negativen Resultaten kommen. • zu große DNA-Mengen im PCR-Ansatz können auf Grund der extremen Sensitivität der Methode zu invaliden Ergebnissen führen • Bei Bestimmung aus ctDNA (Liquid Biopsy) sind Spezialabnahme-Gefäße (10ml Paxgene Röhrchen) erforderlich
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
keine
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
in house Validierung
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