Beschreibung*
Klonalitätsnachweis von Lymphozyten (in isolierten mononukleären Zellen aus Vollblut oder Knochenmarkaspirat) mittels PCR-Amplifkation der rearrangierten Immunglobulingene (Schwer- und Leichtketten) und anschließender Fragmentlängenanalyse.
Ziel und Zweck der Untersuchung
Der PCR-basierte Nachweis von klonalen Immunglobulin Rearrangements kann für die Identifizierung von Klonalitäten in lymphoproliferativen Erkrankungen, zur Unterstützung bei der Unterscheidung zwischen reaktiver Läsion und hämatologischer Malignität, zur Identifizierung von Tumor-spezifischen IGH Gen Rearrangements, für die Beurteilung des Therapieerfolgs und zur Verlaufskontrolle verwendet werden.
Prinzip des Verfahrens
Beim sog. Immunglobulin-Gen-Rearrangement wird je eines der Gensegmente V (variable), D (diversity) und J (joining), die für die Spezifität des jeweiligen Immunglobulins kodieren, auf der Ebene der DNA zusammengefügt, um letzlich ein funktionales Immunglobulin-Gen zu bilden. Der Zusammenbau der Gensegmente erfolgt in der Reihenfolge, dass zunächst das D- und J-Segment miteinander zum DJ-Segment rearrangieren und danach mit dem V-Segment zum VDJ-Segment verbunden werden. Der Rekombinationsvorgang ist dabei nicht exakt. Zusätzlich können auch noch Nukleotide zwischen den Gensegmenten eingebaut werden, um die Vielfalt der möglichen Rearrangements weiter zu erhöhen. Der Immunglobulin-Promotor, der in 5'Richtung (upstream) von den V-Regionen liegt, kommt beim Immunglobulin-Gen-Rearrangement unter den Einfluß des Immunglobulin-Enhancers, der 5' von der konstanten Region liegt. Da dabei die Lese-Raster der Gensegmente übereinstimmen müssen, das Immunglobulin-Gen-Rearrangement jedoch ein zufallsmäßig ablaufender Prozess ist, kommt es nur in ca. einem Drittel aller Fälle zu einem sogenannten produktiven Immunglobulin-Gen-Rearrangement, das die Voraussetzung für die weitere Entwicklung der B-Lymphozyten ist. Falls das Immunglobulin-Gen-Rearrangement bei einem der beiden Allele nicht produktiv war, kann aber auch noch das zweite Allel rearrangiert werden. Die Vielfalt der Antikörpermoleküle wird somit durch diese sog. somatischen Rekombinationen der verschiedenen Genabschnitte der unterschiedlichen Loci (IgH Locus für die schweren Ketten, IgK und IgL Loci für die leichten Ketten) ermöglicht. Die rekombinierten Abschnitte unterscheiden sich nicht nur in der Sequenz sondern auch in der Länge. Mit Primern, die den genomischen Bereich amplifizieren, erhält man daher bei Amplifikation von genomischer DNA aus vielen verschiedenen B-Lymphozyten viele verschieden lange PCR Produkte, während bei klonalen Proliferationen eine PCR Produktlänge dominiert. In den Ig Loci kommt es häufig zu weiteren Veränderungen (Somatische Hypermutation) durch die auch Primerbindungsstellen verändert werden können, so dass Primer möglicherweise nicht mehr binden. Deshalb werden immer mehrere Primer, die in verschiedenen Bereichen der Ig Loci binden, verwendet. Die PCR Produkte werden dann mittels hochauflösender Kapillar-elektrophorese aufgetrennt und durch Fluoreszenzmarkierung sichtbar gemacht (GeneScan Fragmentanalyse). Da eine Klonalitätsbeurteilung mittels Fluoreszenz-basierter Fragmentanalyse manchmal nicht konklusiv ist, wird bei dem im ZIMCL verwendeten Assay unter Verwendung der international empfohlenen Primer der BIOMED-2 Gruppe zusätzlich eine Heteroduplexanalyse der PCR-Produkte durchgeführt.
Literatur
- van Dongen et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 2003; 17:2257–2317. - Expert Opin. Med. Diagn. Immunoglobulin/T-cell receptor clonality diagnostics. 2007; 1(4):451-461.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
Qualitative Analyse: Klonalität nachweisbar / nicht nachweisbar
Synonyme
Klonalitätsnachweis Immunglobulin-Rearrangement Rearrangement IGH
Analysenfrequenz
je nach Anforderung
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24 h, sofern ausreichend Material (Blut, KM) zur MNC-Isolierung vorhanden ist.
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut, Knochenmark
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
5 ml Vollblut, 2 ml KM; Cave: bei zellarmen Materialien sind zur Isolierung einer ausreichenden Zahl von MNC größere Volumina erforderlich!
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
Heparinisierte Spritze für Knochenmarksaspirat
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Probenanlieferung bei 2-8°C, nicht frieren!
Messbereich
Klonalität nachweisbar / nicht nachweisbar
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
•Heparin als Antikoagulans kann die PCR stören •Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
nicht zutreffend
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
IVD-CE
Für die zur Verfügung gestellten Informationen kann keinerlei Gewähr im Hinblick auf Aktualität, Korrektheit, Vollständigkeit oder Qualität übernommen werden. Haftungsansprüche, welche sich auf Schäden materieller oder ideeller Art beziehen, die durch die Nutzung oder Nichtnutzung der dargebotenen Informationen bzw. durch die Nutzung fehlerhafter und unvollständiger Informationen verursacht wurden, sind ausgeschlossen. Die Verwendung und Nutzung der Zusammenstellungen liegt daher alleine im Verantwortungsbereich des Anwenders/der Anwenderin, welche(r) das ZIMCL/tirol kliniken gegenüber Ansprüchen Dritter schad- und klaglos halten wird.