Beschreibung*
Quantitativer molekularer Nachweis von BCR-ABL1 M-bcr p210 (NCN International Scale) bzw. m-bcr p190 aus isolierten Gesamtleukozyten (Erythrozytenlyse Vollblut) mittels Realtime PCR.
Ziel und Zweck der Untersuchung
Die chronische myeloische Leukämie, ist eine klonale myeloproliferative Entartung der pluripotenten Stammzelle des Knochenmarks, die eine exzessive Produktion von transformierten primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen sowie eine myeloide Hyperplasie im Knochenmark zur Folge hat. In 95% der Fälle ist diese maligne Entartung durch eine spezifische zytogenetische Abnormität, die sog. Philadelphia-Translokation bedingt. Neben dieser Form, der klassischen CML, tritt bei den restlichen 5% die atypische CML auf, welche alternative Translokationen, z.T. unter Miteinbeziehung anderer Chromosomen, aufweist 1. Kausal für die Entstehung der CML ist das Auftreten der Philadelphia-Translokation. Neben bei der CML tritt diese spezifische Abnormität auch bei 15-20% der erwachsenen AML Patienten auf. Als Philadelphia Chromosom wird das verkürzte Chromosom 22 bezeichnet, welches durch eine reziproke Translokation zwischen den langen Armen der Chromosome 22 und 9 entsteht. Je nachdem, wo der Bruchpunkt im BCR-Gen ist, kann das Fusionsprotein unterschiedliche Größen (zwischen 185 und 230 kd) annehmen. Mögliche Produkte sind das p190, p210 und in sehr seltenen Fällen das p230 BCR-ABL Protein (sog. minor, major und µ-Bruchpunkt), wobei die biologische Aktivität der Kinase mit zunehmender Größe abnimmt. Die am häufigsten nachweisbare Form ist das p210 (>95% d.F.). Mit der molekularen Quantifizierung des BCR-ABL p210 Transkripts kann der Grad des molekularen Ansprechens evaluiert werden; die Ergebnisse können für die Verlaufsbeobachtung der minimalen Resterkrankung (MRD = minimal residual disease) verwendet werden.
Prinzip des Verfahrens
Die Gesamt-RNA wird revers transkribiert und die so generierte cDNA in einer PCR unter Verwendung eines Paars spezifischer Primer und einer spezifischen, intern mit zwei Farbstoffen (FAM™–TAMRA™) markierten Sonde amplifiziert. Die Sonde bindet bei jedem Annealing-Schritt der PCR an das Amplikon. Wenn die Taq-Polymerase, ausgehend von dem am Amplikon gebundenen Primer, die Strangverlängerung ausführt, verdrängt sie das 5'-Ende der Sonde, das dann durch die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase abgebaut wird. Die Spaltungsreaktion setzt sich fort, bis die verbliebenen Sondenmoleküle vom Amplikon abdissoziieren. Durch diesen Prozess werden Fluorophor und Quencher in die Lösung freigesetzt, wodurch sie räumlich voneinander getrennt werden und es dadurch zu einer Zunahme der FAM-Fluoreszenz und gleichzeitiger Abnahme der TAMRA-Fluoreszenz kommt. Der quantitative Nachweis erfolgt somit mittels spezifischer Sonden für das BCR-ABL p210 bzw p90 Fusionstranskript sowie für das ABL1 Kontrollgen-Transkript, woraus eine normalisierte und nach internationalem Standard berechnete BCRABL-pro-ABL Copynummer errechnet wird.
Literatur
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Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
IS-NCN = BCRABL / ABL %
Synonyme
p210, p190, BCR-ABL MRD, CML Monitoring, BCR-ABL Monitoring, Minimal Residual Disease
Analysenfrequenz
je nach Anforderung
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24 h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut, Knochenmark
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
10 ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Spezielle Präanalytik - Probentransport
INTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG mittels ROHRPOST INS ZIMCL einsenden EXTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG kühlen (2-8°C) und mit COOLPACKS innerhalb von 24h ins ZIMCL versenden. Der rasche, gekühlte Transport ist bei Verlauspatienten UNBEDINGT ERFORDERLICH. Die Proben dürfen nur GEKÜHLT und NICHT EINGEFROREN werden.
Messbereich
BCR-ABL NCN >0,0069%
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
•Heparin als Antikoagulans kann die PCR stören •Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
keine
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
CE-IVD (Ipsogen / QIAGEN)
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