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Parametername: JAK2 V617F Mutationsnachweis

Version: 2 Gültig ab 22.05.2024

Beschreibung* Molekularer Nachweis der JAK2-V617F (G1849T) - Mutation aus mittels Erythrozytenlyse (Vollblut, Knochenmarkaspirat) gewonnenen Gesamtleukozyten mittels ddPCR (digital droplet PCR).

Ziel und Zweck der Untersuchung Mutationen im Gen der Janus-Kinase 2 (JAK2) sind spezifisch für myeloische Neoplasien. Die erworbene Punktmutation V617F (1849G→T) im JAK2-Gen lässt sich bei über 90-95 % der Patienten mit PV und ca. 50-60 % der Patienten mit chronisch idiopathischer Myelofibrose oder essentieller Thrombozythämie nachweisen. JAK2-V617F wurde auch in einigen seltenen Fällen von chronischer myelomonozytärer Leukämie, myelodysplastischem Syndrom, systemischer Mastozytose und chronischer neutrophiler Leukämie detektiert, gar nicht (0 %) dagegen bei CML. Die V617F Mutation führt zu einem Austausch der Aminosäuren Valin gegen Phenylalanin und zu einer Aktivierung des JAK-STAT Signalwegs, was mit einer gesteigerten Teilungsrate bei den betroffenen Zellen einhergeht. Sie ist somit spezifisch für eine klonale Erkrankung und schließt eine erworbene Erythrozytose und reaktive Thrombozytose aus. Aufgrund ihrer Häufigkeit wurde sie als Hauptkriterium in die 2008 revidierte Fassung der WHO zur Diagnose BCR/ABL-negativer myeloproliferativer Neoplasmen aufgenommen.

Prinzip des Verfahrens Das digital droplet PCR-System (ddPCR) beruht auf der Partitionierung eines konventionellen PCR-Ansatzes in bis zu 20.000 Einzelreaktionen (im ZIMCL verwendete Methode: Partitionierung mittels Wasser-Öl-Emulsion). Für gewöhnlich enthält man Partitionen, die eine oder mehrere Kopien der Ziel-DNA sowie Partitionen, die keine Ziel-DNA enthalten. Anschließend wird eine Endpunkt-PCR (z. B. mit Hydrolysesonden) und eine Detektion der Amplifikation für jedes Kompartiment durchgeführt, sodass sich ein positives (1) oder negatives (0) Signal für jede einzelne Partition ergibt. Diese 0/1-Antworten führten zu der Bezeichnung „digitale PCR“. Die Rohdaten werden dann mittels Poisson-Statistik analysiert und die absolute DNA-Ausgangskopienzahl in der Originalprobe bestimmt.
Ein großer Vorteil der ddPCR liegt in der absoluten Quantifizierung von Zielgenen, d.h. eine Quantifizierung ohne Verwendung einer externen Kalibration, z.B. einer Standardkurve. Der zweite große Vorteil der ddPCR ist die Detektion von Mutationen mit geringem allelischen Anteil, die vor allem in der Krebsdiagnostik eine wichtige Rolle spielen. Bei der konventionellen qPCR-Analyse liegt das Hintergrundsignal (Kopienzahl) des Wildtyp-Allels oftmals deutlich über dem der Mutation, sodass eine Detektion der Mutation schwierig ist. Durch die Partitionierung bei der ddPCR wird das Hintergrundsignal des Wildtyps jedoch reduziert und die Mutation innerhalb der Partition aufkonzentriert. Der Nachweis von solchen raren Mutationen spielt v.a. in der MRD-Diagnostik (Minimal Residual Disease, Verlaufskontrollen bei hämatoonkologischen Erkrankungen) eine ausschlaggebende Rolle.
In der ddPCR werden die gleichen Reagenzien und Arbeitsabläufe wie in den meisten Standard TaqMan –Hydrolyseprobe-basierenden PCR-Ansätzen verwendet.
Beim Nachweis der JAK2V617F Mutation kommt die allelspezifische PCR-Technologie zum Einsatz, die einen empfindlichen, genauen und hoch reproduzierbaren Nachweis der SNPs ermöglicht. Nur bei einer perfekten Übereinstimmung zwischen Sonden und Target-DNA kommt es bei der Extension in der PCR zu einer Hydrolyse der Sonde und somit zur Detektion eines Fluoreszenzsignals.

Literatur - Tefferi, A. et al. (2009) Myeloproliferative neoplasms: contemporary diagnosis using histology and genetics. Nat. Rev. Clin. Oncol. 6, 627.
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Ergebniseinheit

Einheiten(sonstige) Qualitative Analyse: JAK2 V617F nachweisbar / nicht nachweisbar.

Synonyme Janus kinase 2 V617F Mutation
MPE
PV
ET
PMF

Analysenfrequenz je nach Anforderung

Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage) 24 h

Spezimen
(Plasma, Serum, Harn) EDTA-Vollblut, Knochenmark

Sammelperiode nicht zutreffend

Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation) 5 ml

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe K-EDTA Monovette

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige) nicht zutreffend

Spezielle Präanalytik - Probentransport Probenanlieferung bei 2-8°C, nicht frieren!

Messbereich qualitative Analyse

Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie) •Heparin als Antikoagulans kann die PCR stören
•Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials

Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch) keine

Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR in house-Validierung

Erklärung nach IVDR 2017/746
(für in-house Methoden) ERKLÄRUNG nach Art. 5 (5) der EU-Verordnung über In-vitro-Diagnostika (EU) 2017/746 (IVDR) zur Eigenherstellung eines IVD in Gesundheitseinrichtungen:

Wir erklären in alleiniger Verantwortung, dass das unten angeführte Produkt, welches im Wege der Eigenherstellung von uns hergestellt wird, allen Anforderungen der IVD-Verordnung (EU) 2017/746, Anhang I Grundlegende Sicherheits- und Leistungsanforderungen, entspricht, die anwendbar sind:

Das Produkt wurde in unseren eigenen Räumlichkeiten von uns in nicht industriellem Maßstab gefertigt und wird ausschließlich in unserer Gesundheitseinrichtung betrieben.

Gesundheitseinrichtung: Tirol Kliniken, Anichstr. 35, 6020 Innsbruck
Geschäftsführer: Mag. Stefan Deflorian
Leiter Qualitätsmanagement: Martin Weichselbraun, MSc.

Produktname: JAK2 V617F Mutationsnachweis

Ort und Datum der Erstellung: Innsbruck, am: 17.07.2014

Produktklassifizierung nach Anhang VIII: Klasse: C

Ausdruck gültig am 28.03.2025

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