Beschreibung*
Molekularer Nachweis der KIT D816V - Mutation in isolierten Leukozyten aus Vollblut und Knochenmarkaspirat mittels ddPCR
Ziel und Zweck der Untersuchung
Die somatische KITD816V Mutation spielt eine zentrale Rolle in der Pathogenese, Diagnose und zielgerichteten (Target-) Behandlung von Systemischer Mastozytose. Die Systemische Mastozytose (SM) ist eine heterogene Gruppe von Krankheiten charakterisiert durch eine klonale Expansion von Mastzellen (MCs) in verschiedenen Organen. Die Einteilung der Systemischen Mastozytose erfolgt nach Richtlinien der WHO zur Klassifizierung von Myeloproliferativen Neoplasmen von 2008. Das c-Kit Gen kodiert für den Stammzellfaktor-Rezeptor Kit. Kit (CD117) ist ein Mitglied der TypIII Rezeptortyrosinkinase-Familie und wird von hämatopoetischen Stammzellen, Mastzellen, Melanozyten und Keimzellen exprimiert. Fast alle Patienten (>95%) mit SM tragen im cKIT-Gen (Exon17) die somatische Punktmutation A2447T, die zu einer Aminosäuresubstitution am Codon 816 (D816V) in der Tyrosinkinase-Domäne des Rezeptors führt. Es handelt sich dabei um eine „gain of function“ Mutation, die eine Autoaktivierung des KIT Rezeptors und in der Folge eine Ligand-unabhängige Proliferation und Differenzierung von neoplastischen Mastzellen verursacht. Die KIT D816V Mutation spielt aufgrund ihrer transformierenden Eigenschaften eine Hauptrolle in SM und ist aus diesem Grund in den Konsensus WHO SM Klassifikationskriterien inkludiert (2008). Zudem führt die D816V Mutation zu einer Resistenz gegenüber des Tyrosinkinase-Inhibitors Imatinibmesylat (Glivec) und somit ist der Nachweis der KIT D816V Mutation sehr bedeutend für die Behandlungsstrategie der SM. Die KIT D816V Mutation kann auch in gastrointestinalen Stroma Tumore (GIST, ~70%), CBF (core-binding-factor)-AML (~15%) und Keimzell-Tumore (~10%) nachgewiesen werden. CBF - AML ist definiert durch das Vorkommen von t(8;21)(q22;q22) - RUNX1-RUNX1T1 oder Inv(16)(p13.1;q22)/t(16;16)(p13.1;q22) - CBFB-MYH11 chromosomale Rearrangements. CBF-AML weisen eine gute Prognose im Vergleich zu AML mit normalem Karyotyp auf. KIT D816V Mutationen sind die häufigsten Mutationen die in CBF-AML zusätzlich nachgewiesen werden (Paschka et al 2006, Park et al 2011, Kristensen et al 2012). Während CBF-AML mit einer günstigen Prognose assoziiert ist, haben Patienten mit einer t(8;21)(q22;q22) - RUNX1-RUNX1T1Translokation mit einer zusätzlichen KIT D816V Mutation eine signifikant schlechtere Prognose.
Prinzip des Verfahrens
Das digital droplet PCR-System (ddPCR) beruht auf der Partitionierung eines konventionellen PCR-Ansatzes in bis zu 20.000 Einzelreaktionen (im ZIMCL verwendete Methode: Partitionierung mittels Wasser-Öl-Emulsion). Für gewöhnlich enthält man Partitionen, die eine oder mehrere Kopien der Ziel-DNA sowie Partitionen, die keine Ziel-DNA enthalten. Anschließend wird eine Endpunkt-PCR (z. B. mit Hydrolysesonden) und eine Detektion der Amplifikation für jedes Kompartiment durchgeführt, sodass sich ein positives (1) oder negatives (0) Signal für jede einzelne Partition ergibt. Diese 0/1-Antworten führten zu der Bezeichnung „digitale PCR“. Die Rohdaten werden dann mittels Poisson-Statistik analysiert und die absolute DNA-Ausgangskopienzahl in der Originalprobe bestimmt. Ein großer Vorteil der ddPCR liegt in der absoluten Quantifizierung von Zielgenen, d.h. eine Quantifizierung ohne Verwendung einer externen Kalibration, z.B. einer Standardkurve. Der zweite große Vorteil der ddPCR ist die Detektion von Mutationen mit geringem allelischen Anteil, die vor allem in der Krebsdiagnostik eine wichtige Rolle spielen. Bei der konventionellen qPCR-Analyse liegt das Hintergrundsignal (Kopienzahl) des Wildtyp-Allels oftmals deutlich über dem der Mutation, sodass eine Detektion der Mutation schwierig ist. Durch die Partitionierung bei der ddPCR wird das Hintergrundsignal des Wildtyps jedoch reduziert und die Mutation innerhalb der Partition aufkonzentriert. Der Nachweis von solchen raren Mutationen spielt v.a. in der MRD-Diagnostik (Minimal Residual Disease, Verlaufskontrollen bei hämatoonkologischen Erkrankungen) eine ausschlaggebende Rolle. In der ddPCR werden die gleichen Reagenzien und Arbeitsabläufe wie in den meisten Standard TaqMan –Hydrolyseprobe-basierenden PCR-Ansätzen verwendet. Beim Nachweis der cKIT D816V Mutation kommt die allelspezifische PCR-Technologie zum Einsatz, die einen empfindlichen, genauen und hoch reproduzierbaren Nachweis der SNPs ermöglicht. Nur bei einer perfekten Übereinstimmung zwischen Sonden und Target-DNA kommt es bei der Extension in der PCR zu einer Hydrolyse der Sonde und somit zur Detektion eines Fluoreszenzsignals.
Literatur
Garcia-Montero et al. Kit mutation in mast cells and other bone marrow hematopoietic cell lineages in systemic mast cell disorders: a prospective study of the Spanish Network on Mastocytosis (REMA) in a series of 113 patients. Blood 2006; 108: 2366-2372 Kristensen et al. Circulating KIT D816V mutation-positive non-mast cells in peripheral blood are characteristic of indolent systemic mastocytosis. Eur J Haem 2012:89: 42-46 Kristensen et al. Systemic Mastocytosis is common in KIT D816V mutation positive core-binding factor acute myeloid leukemia. Leukemia &Lymphoma 2012: 53:1338-1344 Kristensen et al. Sensitive KIT D816V mutatuion analysis of blood as a diagnostic test in mastocytosis. Am J Hematol. 2014:89:493-498 Park et al. Prognostic impact of c-KIT mutations in core binding factor acute myeloid leukemia. Leukemia Research 2011:35:1376-1383 Paschka et al. Adverse prognostic significance of KIT mutations in adult acute myeloid leukemia with inv(16) and t(8;21): A Cancer and Leukemia Group B Study. J Clin Oncol 2006:24: 3904-3911 Tan et al. Sensitive detection of KIT D816V in patients with mastocytosis. Clin Chem 2006:52: 2250-2257 Valent et al: Standards and standardization in mastocytosis: consensus statements of diagnostics, treatment recommendations and response criteria. Eur J Clin Invest 2007:37: 435-453 Valent et al.Guidelines and diagnostic algorithm for patients with supsected systemic mastocytosis: A proposal oft he Austian competence network (AUCNM). Am J Blood Res 2013 3: 174-180
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
Qualitative Analyse: KIT D816V nachgewiesen / nicht nachgewiesen.
Synonyme
Punktmutation D816V des KIT-Gens
Analysenfrequenz
je nach Anforderung
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
Falls DNA aus mittels Erylyse gewonnenen Leukozyten vorhanden ist, 10 Jahre (bei entsprechender Qualtiät der isolierten, archivierten DNA)
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut, Knochenmarkaspirat
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
zumindest 5 ml EDTA-Blut bzw. 3-5 ml Knochenmarkaspirat zur Leukozytenisolierung
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
heparinisierte Spritze für Knochenmarkaspirat
Spezielle Präanalytik - Probentransport
INTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SORFORT NACH GEWINNUNG mittels ROHRPOST ins ZIMCL EXTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SORFORT NACH GEWINNUNG kühlen (2-8°C) und mit Coolpacks innerhalb von 24h ins ZIMCL versenden. EDTA-Vollblut bzw. Knochenmarkaspirat NIEMALS FRIEREN und auch KEINESFALLS auf Gefrierelemente legen!
Messbereich
nicht zutreffend (qualitative Analyse)
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
•Heparinkontamination der Probe •Unzureichende DNA Ausbeute (zu geringe Zellzahl im Primärmaterial, Primärmaterial geronnen) •Unzureichende DNA-Qualität(Degradierung, inadäquate Präanalytik)
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
keine
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
In-house Leistungsbewertung
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