Beschreibung*
Quantitativer molekularer Nachweis von WT (Wilm's Tumor)-1-Gentranskripten aus isolierten mononukleären Zellen mittels qPCR.
Ziel und Zweck der Untersuchung
Ungefähr bei der Hälfte der AML-Patienten existiert kein Leukämie-spezifisches Target (Fusionstranskript), das geeignet wäre, den Krankheitsverlauf zu überwachen; daher besteht ein bedeutendes Interesse an der Entwicklung alternativer Ansätze, die es ermöglichen, ein MRD-Monitoring bei einem größeren Anteil der Patienten durchführen zu können. Das WT1-Gen ist auf Chromosom 11p13 lokalisiert; es kodiert für einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor und wurde ursprünglich als Faktor identifiziert, der an der Pathogenese des Wilms-Tumor beteiligt ist. Das WT1-Gen wird nachweislich bei verschiedenen hämatopoetischen Tumoren, u. a. bei AML, stark exprimiert. Auch wenn die Mechanismen, die zur WT1-Überexpression führen, im Detail noch nicht verstanden sind, lässt sich dieses Phänomenon als Marker ausnutzen, der das Vorliegen, die Persistenz oder das erneute Auftreten einer leukämischen Hämatopoese anzeigt. Die erhaltenen Ergebnisse dienen dazu, das frühzeitige Ansprechen auf die Behandlung zu kontrollieren; sie können auch für die Verlaufsbeobachtung der minimalen Resterkrankung (MRD = minimal residual disease) verwendet werden.
Prinzip des Verfahrens
Die Gesamt-RNA wird revers transkribiert und die so generierte cDNA in einer PCR unter Verwendung eines Paars spezifischer, vom European Leukemia Net (ELN) empfohlener Primer und einer spezifischen, intern mit zwei Farbstoffen (FAM™–TAMRA™) markierten Sonde amplifiziert. Die Sonde bindet bei jedem Annealing-Schritt der PCR an das Amplikon. Wenn die Taq-Polymerase, ausgehend von dem am Amplikon gebundenen Primer, die Strangverlängerung ausführt, verdrängt sie das 5'-Ende der Sonde, das dann durch die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase abgebaut wird. Die Spaltungsreaktion setzt sich fort, bis die verbliebenen Sondenmoleküle vom Amplikon abdissoziieren. Durch diesen Prozess werden Fluorophor und Quencher in die Lösung freigesetzt, wodurch sie räumlich voneinander getrennt werden und es dadurch zu einer Zunahme der FAM-Fluoreszenz und gleichzeitiger Abnahme der TAMRA-Fluoreszenz kommt. Der quantitative Nachweis erfolgt somit mittels spezifischer Sonden für das WT1-Gentranskript sowie für das ABL1 Kontrollgen-Transkript, woraus eine normalisierte WT1-pro-ABL1 Kopienzahl ermittelt werden kann. Das Ergebnis wird dann als WT1-Kopienzahl pro 10.000 ABL1-Kopien ausgegeben.
Literatur
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Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
NCN = WT1 CopyNumber / 10.000 ABL1 CopyNumber
Synonyme
Wilm's Tumor; AML Monitoring; Minimal Residual Disease
Analysenfrequenz
je nach Anforderung
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24 h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut, Knochenmark
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
10 ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
nicht zutreffend
Spezielle Präanalytik - Probentransport
INTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG mittels ROHRPOST INS ZIMCL einsenden EXTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG kühlen (2-8°C) und mit COOLPACKS innerhalb von 24h ins ZIMCL versenden. Der rasche, gekühlte Transport ist bei Verlauspatienten UNBEDINGT ERFORDERLICH. Die Proben dürfen nur GEKÜHLT und NICHT EINGEFROREN werden.
Messbereich
2.2 bis 3838 WT1 copies / 10.000 ABL1 copies (linear)
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
•Heparin als Antikoagulans kann die PCR stören •Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
keine
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
CE-IVD
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