Parameterdetails

Parametername: PML-RARA Translokationsnachweis, quantitativ

Version: 1 Gültig ab 22.05.2024

Beschreibung* Quantitativer molekularer Nachweis von PML-RARA bcr1 bzw. bcr3 aus isolierten mononukleären Zellen (MNC) mittels Realtime PCR.

Ziel und Zweck der Untersuchung Die Translokation PML-RARA t(15;17) ist pathognomonisch für die akute Promyelozytenleukämie (APL, AML M3) und entsteht durch die Translokation des Retinoic acid receptor alpha (RARA) Gens auf dem Chromosom 17q21 mit dem Nuclear regulatory factor Gen auf Chromosom 15q24 (PML), wodurch das PML-RARA Fusionsgenprodukt entsteht.
Die APL macht ca. 10% aller adulten AMLs aus und tritt vorwiegend im mittleren Erwachsenenalter auf. Sie ist häufig mit dem Auftreten einer disseminierten intravasalen Gerinnung (DIC) assoziiert, welche für eine relativ hohe (10-40%) und frühe Mortalität verantwortlich ist und somit eine schnelle Diagnosestellung der AML M3 erforderlich macht.
Da mit All-trans Retinoidsäure (ATRA) eine gute spezifische Therapie verfügbar ist, ist die Prognose der AML M3 besser als bei anderen AML Entitäten. Bei mehr als 90% der Fälle kann eine komplette Remission erreicht werden. Die Einjahresüberlebensrate liegt bei ca. 70%. Mehrere variable Bruchpunkte des PML-Gens sind im Bereich von Intron 3 und Exon 7a beschrieben, während der Bruchpunkt des RARA-Gens im Intron2 recht konstant ist. Ca. 45% aller t(15;17) Translokationen weisen den bcr3 Bruchpunkt auf (sog. S-Form), ca. 50% den bcr1-Bruchpunkt (sog. L-Form) und weniger als 5% der Fälle den bcr2 Bruchpunkt (sog. V-Form) auf.
Bei 35-45% aller Patienten mit APL können zusätzlich Mutationen im FLT3 Gen nachgewiesen werden.
Ein kleiner Teil der Patienten mit an APL erinnernder Morphologie zeigt alternative Translokationsvarianten des RARA Gens mit anderen Fusionspartnern wie ZBTB16 t(11;17), NPM1 t(5;17) oder NUMA1 t(11;17), welche tlw. mit einem schlechteren Ansprechen auf ATRA assoziiert sind.

Anmerkung zur Untersuchungsmethode: Mittels quantitativer PCR kann im ZIMCL entweder das PML-RARA bcr1 oder das PML-RARA bcr3 Fusionstranskript quantifiziert werden. Wir weisen ausdrücklich darauf hin, dass der Einsender für die korrekte Angabe der vorliegenden PML-RARA Fusionsvariante verantwortlich ist, zumal die nicht korrekte Angabe der beim Patienten vorliegenden PML-RARA Fusionsvariante am Anforderungsschein den Einsatz des falschen Testsystems zur Folge haben, somit zu einem falsch negativen Ergebnis und in der Folge zu Behandlungsfehlern führen kann. Sollte bei dem von Ihnen betreuten Patienten eine von der bcr3 S-Form und bcr1 L-Form abweichende Variante vorliegen, ist eine telefonische Kontaktaufnahme erforderlich, um ein geeignetes Therapiemonitoring zu vereinbaren.
Mittels qualitativer PML-RARA PCR können die Fusionstranskripte bcr1 (L-Form), bcr2 (V-Form) sowie bcr3 (S-Form) erfasst werden.

Prinzip des Verfahrens Die aus der mononukleären Zellfraktion der Patientenprobe isolierte Gesamt-RNA wird revers transkribiert und die so generierte cDNA in einer PCR unter Verwendung eines Paars spezifischer Primer und einer spezifischen, intern mit zwei Farbstoffen (FAM™–TAMRA™) markierten Sonde amplifiziert. Die Sonde bindet bei jedem Annealing-Schritt der PCR an das Amplikon. Wenn die Taq-Polymerase, ausgehend von dem am Amplikon gebundenen Primer, die Strangverlängerung ausführt, verdrängt sie das 5'-Ende der Sonde, das dann durch die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase abgebaut wird. Die Spaltungsreaktion setzt sich fort, bis die verbliebenen Sondenmoleküle vom Amplikon abdissoziieren. Durch diesen Prozess werden Fluorophor (FAM) und Quencher (TAMRA) in die Lösung freigesetzt, wodurch sie räumlich voneinander getrennt werden und es dadurch zu einer Zunahme der FAM-Fluoreszenz und gleichzeitiger Abnahme der TAMRA-Fluoreszenz kommt.
Der quantitative Nachweis erfolgt somit mittels spezifischer Primerpaare und einer Sonde für das PML-RARA bcr1 oder bcr3 Fusionstranskript sowie einer, in jedem Ansatz mitgeführten bcr1 bzw. bcr3-Standardkurve. Die erhaltene PML-RARA Kopienzahl wird mit der in der Patientenprobe vorliegenden ABL1 Kontrollgen-Transkriptzahl in Realtion gesetzt, woraus eine auf ABL1 normalisierte PML-RARA Kopienzahl errechnet wird.

Literatur Gabert et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 2003 Dec;17(12):2318-57.

Beillard et al. Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe against cancer program.
Leukemia. 2003 Dec;17(12):2474-86.

Kern et al. Monitoring of minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Cancer. 2008 Jan 1;112(1):4-16.

Ergebniseinheit

Einheiten(sonstige) % PML-RARA/ABL1 bzw. Kopien PML-RARA/10000 Kopien ABL1

Synonyme bcr1 L-Form, bcr3 S-Form, PML-RARA MRD, APL Monitoring, AML M3 Monitoring, Minimal Residual Disease

Analysenfrequenz je nach Anforderung

Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage) 24 h

Spezimen
(Plasma, Serum, Harn) EDTA-Vollblut, Knochenmark

Sammelperiode nicht zutreffend

Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation) 10 ml

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe K-EDTA Monovette

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige) nicht zutreffend

Spezielle Präanalytik - Probentransport INTERN:
EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG mittels ROHRPOST INS ZIMCL einsenden

EXTERN:
EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG kühlen (2-8°C) und mit COOLPACKS innerhalb von 24h ins ZIMCL versenden.

Der rasche, gekühlte Transport ist bei Verlauspatienten UNBEDINGT ERFORDERLICH. Die Proben dürfen nur GEKÜHLT und NICHT EINGEFROREN werden.

Messbereich PML-RARA/ABL1 >0,018% NCN

Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie) •Heparin als Antikoagulans kann die PCR stören
•Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials

Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch) keine

Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR in-house validierter RUO-Assay

Erklärung nach IVDR 2017/746
(für in-house Methoden) ERKLÄRUNG nach Art. 5 (5) der EU-Verordnung über In-vitro-Diagnostika (EU) 2017/746 (IVDR) zur Eigenherstellung eines IVD in Gesundheitseinrichtungen:

Wir erklären in alleiniger Verantwortung, dass das unten angeführte Produkt, welches im Wege der Eigenherstellung von uns hergestellt wird, allen Anforderungen der IVD-Verordnung (EU) 2017/746, Anhang I Grundlegende Sicherheits- und Leistungsanforderungen, entspricht, die anwendbar sind:

Das Produkt wurde in unseren eigenen Räumlichkeiten von uns in nicht industriellem Maßstab gefertigt und wird ausschließlich in unserer Gesundheitseinrichtung betrieben.

Gesundheitseinrichtung: Tirol Kliniken, Anichstr. 35, 6020 Innsbruck
Geschäftsführer: Mag. Stefan Deflorian
Leiter Qualitätsmanagement: Martin Weichselbraun, MSc.

Produktname: PML-RARA Translokationsnachweis, quantitativ

Ort und Datum der Erstellung: Innsbruck, am: 05.02.2017

Produktklassifizierung nach Anhang VIII: Klasse: C

Ausdruck gültig am 28.03.2025

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