Parameterdetails

Parametername: EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) Mutationsnachweis aus Plasma-DNA

Version: 2 Gültig ab 06.03.2025

Beschreibung* Nachweis von Deletionen in Exon 19 und Substitutionen (T790M, L858R) in den Exons 20 und 21 des EGFR-Gens in cfDNA mittels Realtime PCR

Ziel und Zweck der Untersuchung Der Epidermal Growth Factor Rezeptor (EGFR) ist Startpunkt einer Signalkaskade (EGFR->KRAS->BRAF->MEK->ERK), die bei der Kontrolle des Zellwachstums eine entscheidende Rolle spielt. Bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) kommt es häufig zu Mutationen, welche den EGFR aktivieren und so ein unkontrolliertes Zellwachstum auslösen. Eine Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren, TKIs, (z.B. Gefitinib-IRESSA, Erlotinib-TARCEVA, Afatinib-GIOTRIF) kann dem entgegenwirken.
Etwa 15-20% der Kaukasier mit NSCLC weisen aktivierende EGFR-Mutationen auf, von denen ca. 45% im EGFR Exon 19 (Deletionen im sog. LREA-Abschnitt zwischen den Aminosäurepositionen 747-750) und 40-45% im Exon 21 (L858R; Punktmutation, die am Codon 858 zu einem Austausch von Arginin durch Leucin führt) liegen. Daneben finden sich noch ca. 5% der aktivierenden Mutationen im Exon 18 (Codon 719), vereinzelt sind aktivierende Veränderungen im Exon 20 beschrieben.
Trotz initial raschem und eindrucksvollem Ansprechen auf eine Therapie mit EGFR-TKIs kommt es leider bei einer Vielzahl von Patienten zur Resistenzentwicklung gegenüber der Therapie. Sofern es sich bei der auftretenden Resistenzmutation um eine sog. T790M Mutation (im Exon 20 des EGFR-Gens) handelt, kann durch Umstellung auf neu entwickelte Drittgenerations-TKI wie z.B. Osimertinib-TAGRISSO die Therapie erfolgreich fortgeführt werden.
Neben einer erworbenen T790M Mutation können jedoch auch andere sekundäre Resistenzmechanismen (wie bspw. MET-, AXL-, HER2-Amplifikationen, PIK3CA- und BRAF-Mutationen) auftreten, welche den Therapieerfolg ebenfalls beeinträchtigen können.
Bei fortgeschrittenem oder metastasiertem NSCLC sind die für die molekulare Diagnosestellung verfügbaren Gewebeproben üblicherweise sehr klein, so dass die Ausfallsraten bei der molekularen Untersuchung zwischen 5% und 30% liegen (Hlinkova K 2013, Leary AF 2012, Shiau CJ 2014). Noch schwieriger gestaltet sich nicht nur die praktische Durchführung einer Re-Biopsie, sondern vor allem auch die Gewinnung von Material, welches für die molekulare Untersuchung geeignet ist (Yoon HJ 2012, Redig AJ 2015).

Die Bestimmung des EGFR-Mutationsstatus in zellfreier Plasma DNA ist somit einerseits eine wertvolle Ergänzung bei der Identifizierung von Patienten mit NSCLC, andererseits eine wichtige Alternative für Patienten, die von einer Behandlung mit TKIs profitieren könnten, wenn gar keine Gewebeprobe untersucht werden kann oder die (Re)Biopsie von Seite des Patienten abgelehnt wird. Des Weiteren dient der Nachweis von EGFR-Mutationen aus Plasma-DNA zur Verlaufskontrolle von Patienten unter Therapie, zumal die erworbenen Resistenzmutationen während der Behandlungsdauer häufigen Veränderungen (zeitlich und auch abhängig vom Biopsieort) unterliegen (Piotrowska T 2014).
In einer rezenten Metaanalyse (Qiu M, 2015) wurde gezeigt, dass die Analyse des EGFR-Mutationsstatus in Plasma-DNA eine Spezifität von durchschnittlich 96% sowie eine hohe Konkordanz verglichen mit der Gewebebiopsie aufweist. Die in der Metaanalyse aus 2015 berechnete durchschnittliche Sensitivität von 62% ist geringer verglichen mit einer Untersuchung aus Gewebe, wobei derzeit jedoch deutliche Sensitivitätssteigerungen durch verbesserte DNA-Extraktionsverfahren aus Plasma und sensitivere molekulare Nachweisverfahren zu verzeichnen sind (Perez-Ramirez C, 2016).

Prinzip des Verfahrens PCR-Amplifikation von isolierter Plasma-DNA und Identifizierung von Mutationen im EGFR Gen mittels Taqman Realtime-PCR. Der Nachweis der aktivierenden Mutationen (LREA-Deletionen im EGFR Exon 19 und L858R Mutation im Exon 21) sowie der T790M Resistenzmutation im EGFR Exon 20 erfolgt mittels hochsensitiver allelspezifischer qPCR Analyse unter Verwendung von Hydrolyse-Probes und Baseblocker sowie der Verwendung von FAM- und HEX-markierten Gensonden.

Qualitätssicherung:
Vor Durchführung der spezifischen EGFR-Mutationsanalysen aus dem Patientenplasma erfolgt nach Extraktion der Plasma-DNA eine Quantifizierung und Qualitätsüberprüfung der DNA. Im Rahmen der EGFR-Mutationsanalyse wird zusätzlich für jede Patientenprobe eine Kontroll-PCR mitgeführt, wodurch gewährleistet ist, dass ausreichend isolierte Plasma-DNA in die spezifischen Mutations-PCRs eingesetzt wurde und so die ZIMCL-internen Sensitivitätsvorgaben eingehalten werden konnten. Dieser Kontroll-Assay dient zur Bestimmung der vervielfältigbaren Gesamt-DNA in jeder Patientenprobe.

Mit dem Testsystem erfasste Mutationen:
EGFR exon 20 c.2369C>T Thr790Met (T790M) COSM6240
EGFR exon 21 c.2573T>G Leu858Arg (L858R) COSM6224
EGFR exon19 Deletionen:
c.2240_2251del12 p.L747_T751>S COSM6210
c.2239_2247del9 p.L747_E749delLRE COSM6218
c.2238_2255del18 p.E746_S752>D COSM6220
c.2235_2249del15 p.E746_A750delELREA COSM6223
c.2236_2250del15 p.E746_A750delELREA COSM6225
c.2235_2246del12 p.E746_E749delELRE COSM28517
c.2239_2256del18 p.L747_S752delLREATS COSM6255
c.2237_2254del18 p.E746_S752>A COSM12367
c.2240_2254del15 p.L747_T751delLREAT COSM12369
c.2240_2257del18 p.L747_P753>S COSM12370
c.2239_2248>C (complex) p.L747_A750>P COSM12382
c.2239_2251>C (complex) p.L747_T751>P COSM12383
c.2237_2255>T (complex) p.E746_S752>V COSM12384
c.2235_2255>AAT (complex) p.E746_S752>I COSM12385
c.2237_2252>T (complex) p.E746_T751>V COSM12386
c.2239_2258>CA (complex) p.L747_P753>Q COSM12387
c.2239_2256>CAA (complex) p.L747_S752>Q COSM12403
c.2237_2253>TTGCT (complex) p.E746_T751>VA COSM12416
c.2238_2252>GCA (complex) p.L747_T751>Q COSM12419
c.2238_2248>GC (complex) p.L747_A750>P COSM12422
c.2237_2251del15 p.E746_T751>A COSM12678
c.2236_2253del18 p.E746_T751delELREAT COSM12728
c.2235_2248>AATTC (complex) p.E746_A750>IP COSM13550
c.2235_2252>AAT (complex) p.E746_T751>I COSM13551
c.2235_2251>AATTC (complex) p.E746_T751>IP COSM13552
c.2237_2257>TCT (complex) p.E746_P753>VS COSM18427
c.2237_2251del15 p.L747_T751delLREAT COSM23571
c.2233_2247del15 p.K745_E749delKELRE COSM26038
c.2234_2248del15 p.K745_A750>T COSM1190791
c.2236_2248>CAAC (complex) p.E746_A750>QP COSM13557
c.2232_2249del18 p.K745_A750delKELREA COSM221565
c.2237_2253>TA (complex) p.E746_T751>V COSM133192
c.2239_2257>T (complex) p.L747_P753>S COSM133197
c.2239_2253>AAT (complex) p.L747_T751>N COSM51503
c.2236_2259>ATCTCG (complex) p.E746_P753>IS COSM133191

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Ergebniseinheit

Einheiten(sonstige) qualitative Analyse (Mutation nachgewiesen/nicht nachgewiesen)

Synonyme Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor
epidermal growth factor receptor
T790M
Gefitinib
Erlotinib
Afatinib
Osimertinib
NSCLC
L858R
Exon 19 Deletion
LREA

Analysenfrequenz nach Anforderung

Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage) nicht zutreffend (Spezialmonovette erforderlich)

Spezimen
(Plasma, Serum, Harn) Plasma (Streck oder Paxgene-Röhrchen)

Sammelperiode nicht zutreffend

Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation) 10 ml Vollblut (Paxgene Röhrchen)

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige) 10ml Paxgene Spezial-Monovette (bitte keinesfalls geringeres Volumen!)

Spezielle Präanalytik - Probentransport INTERN:
Streck oder PAXgene Blood ccfDNA-Spezialmonovetten erforderlich. Blut unmittelbar nach Gewinnung mittels ROHRPOST INS ZIMCL einsenden

EXTERN:
PAXgene Blood ccfDNA-Spezialmonovetten erforderlich. Blut unmittelbar nach Gewinnung bei Raumtemperatur ins ZIMCL versenden.

Messbereich Nachweis der therapie-relevanten EGFR-Mutationen T790M, L858R und Exon19-Deletionen (qualitative Analyse). Liste der erfassten Mutationen siehe Punkt

Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie) - Unzureichende DNA-Qualität und -Ausbeute(Degradierung, inadäquate Präanalytik)
- Überprüfung des Einflusses exogener Störsubstanzen (div. Metabolite und Arzneimittel) ist erfolgt. Für Detailinformationen ist eine telefonische Kontaktaufnahme erforderlich.

Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch) nicht zutreffend

Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR IVD-CE

Erklärung nach IVDR 2017/746
(für in-house Methoden) nicht zutreffend

Ausdruck gültig am 28.03.2025

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