Beschreibung*
Nachweis von Mutationen im FLT3 (fms-related tyrosine kinase 3) Gen in isolierten mononukleären Zellen (Vollblut, Knochenmarkaspirat) mittels PCR und nachfolgender Genescan-Fragmentanalyse
Ziel und Zweck der Untersuchung
Aktivierende Mutationen des FLT3-Gens finden sich in etwa 20-25 % der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML). Das FLT3-Gen kodiert für eine Tyrosinkinase, die eine wichtige Rolle im Wachstum und der Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen spielt. Die häufigste aktivierende Veränderung des FLT3-Gens ist die interne Tandemduplikation (FLT3-ITD), die sich vorzugsweise bei der AML mit normalem Karyotyp findet (Kottardis et al). FLT3-ITDs sind sehr variabel hinsichtlich Größe des duplizierten Fragments, Insertionsstelle, Anzahl an Klonen sowie dem Verhältnis von mutiertem und Wildtyp FLT3-Allel, die sog. allelische Ratio (Kayser et al, Thiede et al). Häufige kooperierende Mutationen bei der AML mit FLT3-ITD finden sich in den Genen Nucleophosmin (NPM1) und DNA-Methyltransferase 3A (DNMT3A, Schlenk et al 2008). Klinisch ist die AML mit FLT3-ITD durch eine ungünstige Prognose aufgrund einer höheren Relapsrate charakterisiert, wobei die FLT3-ITD allelische Ratio und die Insertionsstelle der FLT3-ITD einen Einfluss auf das Therapieansprechen und das Überleben zu haben scheinen (Schlenk et al 2012). Der Multikinase-Inhibitor Midostaurin kann in Kombination mit Standardchemotherapie das Überleben von Patienten mit neu diagnostizierter akuter myeloischer Leukämie (AML) und FLT3-Mutation verlängern (Phase-3-Studie RATIFY) und stellt somit einen neuen Therapiestandard dar (Stone et al. 2017). Die prognostische Signifikanz von Punktmutationen in der TKD (zumeist an der Stelle D835 oder I836) ist derzeit noch unklar und hängt möglicherweise von der gleichzeitigen Anwesenheit anderer Mutationen ab, der Benefit von Midostaurin ist jedoch innerhalb der FLT3-Mutationssubtypen konsistent. Die im ZIMCL etablierte Methode ermöglicht sowohl die Untersuchung der ITD-Mutationen (Insertionsmutationen) als auch den Nachweis der TKD-D835 Mutation (Punktmutation) im FLT3 Gen.
Prinzip des Verfahrens
Endpunkt-PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern (FLT3-ITD Exons 14 bis 15 bzw. FLT3-TKD Exon 20) mit anschließendem Restriktionsenzymverdau (TKD) bzw. Kapillarelektrophorese.
Literatur
Stone et al. Midostaurin plus Chomotherapy for Acute Myolid Leukemia with a FLT3 Mutation. N. Engl Journal of Med. 2017: 377; 454-464 Stone et al. 57. Jahreskongress der American Society of Hematology (ASH) 2015, Orlando/USA. Schlenk et al. Midostaurin nach Chemotherapie und allogener Blutstammzelltransplantation bei Patienten mit AML und FLT3-ITD (AMLSG 16-10 Studie). Kompetenznetz Leukämien, AMLSG 16-10 Studie, Rundbrief 17, Dez. 2012 Kottaridis et al. The presence of a FLT3 internal tandem duplication in patients with acute myeloid leukemia (AML) adds important prognostic information to cytogenetic risk group and response to the first cycle of chemotherapy: analysis of 854 patients from the United Kingdom Medical Research Council AML 10 and 12 trials. Blood. 2001 Sep 15;98(6):1752-9. Kayser et al. Insertion of FLT3 internal tandem duplication in the tyrosine kinase domain-1 is associated with resistance to chemotherapy and inferior outcome. Blood. 2009 Sep 17;114(12):2386-92. Murphy et al. Detection of FLT3 Internal Tandem Duplication and D835 Mutations by a multiplex Polymerase chain reaction and capillary electrophoresis assay. Journal of Molecular diagnostics 2003, Vol 5/2: 96-102 Thiede et al. Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia: association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis. Blood. 2002 Jun 15;99(12):4326-35. Schlenk et al. Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 2008, 358/18:1909-18.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
FLT3-ITD: Qualitative Analyse, Bestimmung Ratio mut.Allel/WT-Allel. . FLT3-D835: Qualitative Analyse
Synonyme
FLT3 ( fms-related tyrosine kinase 3 gene) FLT3-ITD (internal tandem duplication) FLT3-TKD (Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne, Codon D835)
Analysenfrequenz
wöchentlich
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
Falls DNA aus MNC Fraktion der Leukozyten vorhanden ist, 10 Jahre (bei entsprechender Qualität der isolierten, archivierten DNA)
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut, Knochenmarkaspirat;
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
zumindest 5ml EDTA-Blut bzw. 3-5ml Knochenmark zur Leukozytenisolierung
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
Heparinisierte Spritze für Knochenmarkaspirat
Spezielle Präanalytik - Probentransport
INTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG mittels ROHRPOST INS ZIMCL einsenden EXTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG kühlen (2-8°C) und mit COOLPACKS innerhalb von 24h ins ZIMCL versenden. EDTA-Vollblut bzw. Knochenmarkaspirat NIEMALS FRIEREN und auch KEINESFALLS auf Gefrierelemente legen!
Messbereich
nicht zutreffend (qualitative Analyse)
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
- Unzureichende DNA-Ausbeute (zu geringe Zellzahl im Primärmaterial, Primärmaterial geronnen) - Unzureichende DNA-Qualität (Degradierung, inadäquate Präanalytik) - Heparinkontamination der Probe
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
nicht zutreffend
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
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