Beschreibung*
Nachweis von Mutationen in den häufigsten mit myelodysplastischem Syndrom, myeloproliferativen Neoplasien, Lymphomen sowie akuter und chronischer Leukämie assoziierten Gene im Rahmen der molekulargenetischen Leukämie-Charakterisierung aus Vollblut oder Knochenmark mittels Next-Generation-Sequencing (NGS).
Ziel und Zweck der Untersuchung
Bei der Diagnostik, Klassifikation und Prognoseabschätzung akuter und chronischer Leukämien, Lymphomen, myeloproliferativen Neoplasien (MPN) und myelodysplastischen Syndromen gewinnt die molekulargenetische Abklärung zunehmend an Bedeutung. Diverse genetische Veränderungen (z. B. Punktmutationen, Insertionen, Deletionen, Translokationen, Inversionen u.a.) sind stark mit einem spezifischen morphologischen oder immunphänotypischen Leukämie-/MPN/MDS-Subtyp assoziiert. Demzufolge sieht auch die WHO-Klassifikation der akuten Leukämie (2016) die genetische Untersuchung als wichtigen Zusatz zur Morphologie, Immunphänotypisierung und Klinik bei der Definition der unterschiedlichen Subtypen vor. Der molekulargenetische Nachweis spezifischer Genveränderungen ist daher von diagnostischer, therapeutischer und letztlich prognostischer Bedeutung. Die im ZIMCL etablierten und validierten Gen-Panels erfassen Mutationen in den häufigsten Genen für folgende Krankheitsentitäten: - Akute myeloische Leukämie - Myelodysplastisches Syndrom - MDS/MPN-Overlap Syndrom, aCML/CMML/JMML - Akute lymphatische Leukämie - Chronisch lymphatische Leukämie - Mastozytose - Myeloproliferative Neoplasien - Lymphome Je nach ausgewählter Fragestellung werden die am häufigsten betroffenen Krankheits-assoziierten Gene (codierende Regionen, splice-Übergängen sowie Interne Tandem Duplikationen/Deletionen) untersucht. Die im ZIMCL etablierte Gen-Panels (v2) umfassen je nach Fragestellung die Sequenzierung der Mutationshotspots der Gene ABL1 (NM_005157.5, Exons 4-9), ASXL1 (NM_015338.5, Exons 10,12-13), BRAF (NM_004333.4, Exons 11,15), CALR (NM_004343.3, Exons 8-9), CBL (NM_005188.3, Exons 8-9), CREBBP (NM_004380.2, Exons 26-27), FLT3 (NM_004119.2, Exons 13-15,20), HRAS (NM_005343.3, Exons 2-3), IDH1 (NM_005896.3, Exon 4), IDH2 (NM_002168.3, Exon 4), KIT (NM_000222.2, Exons 2,8-11,13,17-19), KRAS (NM_004985.4, Exons 2-3), MPL (NM_005373.2, Exon 10), NOTCH1 (NM_017617.4, Exons 26-27,34), NPM1 (NM_002520.6, Exons 10-11), NRAS (NM_002524.4, Exons 2-3), PTPN11 (NM_002834.4, Exons 3,7-13), SETBP1 (NM_015559.2, Exon 4), SF3B1 (NM_012433.3, Exons 10-16), SRSF2 (NM_003016.4, Exons 1), STAT3 (NM_003150.3, Exons 20-21), U2AF1 (NM_006758.2, Exons 2,6), WT1 (NM_000378.4, Exons 5-9) sowie die vollständige Sequenzierung der Gene ATM NM_000051.3 BCL2 NM_000633.2 BIRC3 NM_001165.4 CEBPA NM_004364.4 CSF3R NM_000760.3 CXCR4 NM_003467.2 DNMT3A NM_022552.4 ETV6 NM_001987.4 EZH2 NM_004456.4 JAK2 NM_004972.3 MYD88 NM_002468.4 RUNX1 NM_001754.4 TET2 NM_001127208.2 TP53 NM_000546.5 ZRSR2 NM_005089.3 Wir weisen darauf hin, dass somatische Mutationen in den genannten Genen u.U. auch bei Gesunden im Rahmen einer sog. klonalen Hämatopoese (CHIP, potentielle Vorstufe analog zu MGUS) auftreten können und ersuchen daher um Bewertung in Zusammenschau mit Klinik und anderen (Labor)Befunden. Der klinische Impact von Mutationen <10% VAF (zB im Rahmen von subklonalen Tumorpopulationen) ist gegenwärtig noch unklar. Die Bewertung der Ergebnisse ist nur in Zusammenschau mit Immunphänotypisierung, Zytologie sowie anderen histopathologischen Befunden sinnvoll und liegt in der Verantwortung des behandelnden Arztes. Da mit dem eingesetzten Verfahren Keimbahn- und somatische Varianten nicht definitiv unterschieden werden können, kann bei klinischer Indikation eine Keimbahnanalyse mit entsprechender Beratung erforderlich sein.
Prinzip des Verfahrens
Target-Enrichment Next-Generation-Sequencing. Der Workflow des Verfahrens umfasst vier Schritte: 1. Library Herstellung Die Sequencing Library erfolgt durch eine zufällige Fragmentierung der eingesetzten DNA, gefolgt von einer 5‘ und 3‘ Adapter Ligation. Die Adapter-ligierten Fragmente werden anschließend amplifiziert und aufgereinigt. 2. Cluster Generation – Hierfür wir die Library auf eine Flow Cell geladen, wo die Fragmente durch Bindung an komplementäre Oligo-Sequenzen gebunden werden. Jedes Fragment wird sodann amplifiziert und bildet durch Bridge-Amplification einen eigenen klonalen Cluster. 3. Sequenzierung: Durch Zugabe von verschieden Fluoreszenz-markierten Nukleotiden kann pro Sequenzierzyklus (entsprechend der verwendeten Leselänge) der Einbau eines bestimmten Nukleotids in jeden DNA Template Strang in Millionen von Clustern parallel optisch anhand der unterschiedlichen Emissionswellenlängen detektiert und in die entsprechende Base übersetzt werden (sog. Sequencing by synthesis). 4. Daten Analyse Die analysierten Sequenzen werden an die Sequenz des Referenzgenoms angeglichen, wodurch Abweichungen zur Referenzsequenz (SNV, Inseretionen, Deletionen etc.) bioinformatisch nachgewiesen werden können. Anschließend erfolgt die medizinische Interpretation der gefundenen Varianten in Zusammenschau mit internationalen Referenz-Datenbanken.
Literatur
Arber et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016 May 19;127(20):2391-405. Döhner et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 2017 Jan 26;129(4):424-447. Haferlach et al. Landscape of genetic lesions in 944 patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 2014 Feb;28(2):241-7.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
Qualitative Analyse; zu erwartende Ergebnisse: Nachweis / kein Nachweis von Mutationen in den untersuchten Gen-Regionen
Synonyme
Leukämie-Typisierung molekulargenetisch, AML Typisierung, ALL Typisierung, Lymphom Typisierung, Leukämie Prognosemarker Panel, MDS/MPN Typisierung, CLL Prognosemarker, Mastozytose Typisierung, erweitertes MPE Panel
Analysenfrequenz
wöchentlich
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
12 Stunden (im Einzelfall Rücksprache mit verantw. FA)
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut; Knochenmark
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
pB: 5-10ml, KM: 3ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
EDTA-KM, Heparin-KM
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Material unmittelbar nach der Gewinnung gut mit dem jeweiligen Antikoagulans durchmischen (Knochenmarkaspirate sind häufig angeronnen-keine Zellisolierung möglich!), auf 4 Grad stellen und gekühlt so rasch als möglich ins ZIMCL transportieren. Die Proben dürfen nur gekühlt und nicht gefroren werden. Nicht aliquotieren. Keine Annahme von Sekundärröhrchen! Laut österreichischem Gentechnikgesetz ist bei Typ I-Untersuchungen KEINE schriftliche Einverständniserklärung zur Durchführung der Genanalyse erforderlich.
Messbereich
Qualitative Analyse; untersuchte Gen-Regionen siehe allg. Beschreibung
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
- Schlechte Durchmischung des Knochenmarkaspirates mit dem Antikoagulans - generell unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials Größere InDels >150bp, InDels in einer einzelnen Capture-Region, Varianten in Homopolymerregionen (>10bp) oder wenig komplexen Sequenzabschnitten, Genfusionen sowie Copy Number Variations werden nicht erfasst.
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
nicht zutreffend (sequenzspezifisches Anreicherung, mindestens 1000fache Coverage aller untersuchten Loci)
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
in house Validierung
Für die zur Verfügung gestellten Informationen kann keinerlei Gewähr im Hinblick auf Aktualität, Korrektheit, Vollständigkeit oder Qualität übernommen werden. Haftungsansprüche, welche sich auf Schäden materieller oder ideeller Art beziehen, die durch die Nutzung oder Nichtnutzung der dargebotenen Informationen bzw. durch die Nutzung fehlerhafter und unvollständiger Informationen verursacht wurden, sind ausgeschlossen. Die Verwendung und Nutzung der Zusammenstellungen liegt daher alleine im Verantwortungsbereich des Anwenders/der Anwenderin, welche(r) das ZIMCL/tirol kliniken gegenüber Ansprüchen Dritter schad- und klaglos halten wird.