Beschreibung*
Nachweis von Mutationen in den häufigsten mit myelodysplastischem Syndrom, myeloproliferativen Neoplasien, Lymphomen sowie akuter und chronischer Leukämie assoziierten Gene im Rahmen der molekulargenetischen Leukämie-Charakterisierung aus Vollblut oder Knochenmark mittels Next-Generation-Sequencing (NGS).
Ziel und Zweck der Untersuchung
Bei der Diagnostik, Klassifikation und Prognoseabschätzung akuter und chronischer Leukämien, Lymphomen, myeloproliferativen Neoplasien (MPN) und myelodysplastischen Syndromen gewinnt die molekulargenetische Abklärung zunehmend an Bedeutung. Diverse genetische Veränderungen (z. B. Punktmutationen, Insertionen, Deletionen, Translokationen, Inversionen u.a.) sind stark mit einem spezifischen morphologischen oder immunphänotypischen Leukämie-/MPN/MDS-Subtyp assoziiert. Demzufolge sieht auch die WHO-Klassifikation der akuten Leukämie (2022) die genetische Untersuchung als wichtigen Zusatz zur Morphologie, Immunphänotypisierung und Klinik bei der Definition der unterschiedlichen Subtypen vor. Der molekulargenetische Nachweis spezifischer Genveränderungen ist daher von diagnostischer, therapeutischer und letztlich prognostischer Bedeutung. Die im ZIMCL etablierte und validierte Next-Generation-Sequencing Methode erfasst Mutationen in den häufigsten Genen für folgende Krankheitsentitäten: - Akute myeloische Leukämie - Myelodysplastisches Syndrom - MDS/MPN-Overlap Syndrom, aCML/CMML/JMML - Akute lymphatische Leukämie - Chronisch lymphatische Leukämie - Mastozytose - Myeloproliferative Neoplasien - Lymphome Je nach ausgewählter Fragestellung werden die am häufigsten betroffenen Krankheits-assoziierten Gene (codierende Regionen, splice-Übergängen sowie Duplikationen/Deletionen/CNVs) untersucht. Die im ZIMCL etabliert NGS-Methode umfasst je nach Fragestellung die vollständige Sequenzierung der Gene ATM NM_000051.4, BCL2 NM_000633.3, BCOR NM_017745.6, BCORL1 NM_021946.5 BIRC3 NM_001165.5, CEBPA NM_004364.5, CSF3R NM_000760.4, CXCR4 NM_003467.3, DNMT3A NM_022552.5, ETNK1 NM_018638.5 ETV6 NM_001987.5 EZH2 NM_004456.5, GATA2 NM_032638.5, GNB1 NM_002074.5, JAK2 NM_004972.4, KMT2A NM_005933.4, MAP2K1 NM_002755.4 MYC NM_002467.6, MYD88 NM_002468.5, NF1 NM_000267.3 PHF6 NM_032335.3 PIGA NM_002641.4 PPM1D NM_003620.4 PRPF8 NM_006445.4 RUNX1 NM_001754.5, STAG2 NM_006603.5, TET2 NM_017628.4, TP53 NM_000546.6, UBA1 NM_003334.4, ZRSR2 NM_005089.4 sowie die Sequenzierung der Mutationshotspots der Gene ABL1 NM_005157.6 (4-9), ASXL1 NM_015338.6 (10,12-13), BCL6 NM_001706.5 (8‐9), BRAF NM_004333.6 (11,15), BTK NM_000061.3 (15), CALR NM_004343.4 (8-9), CBL NM_005188.4 (8-9), CREBBP NM_004380.3 (26-27), FLT3 NM_004119.3 (13-15,20), HRAS NM_005343.4 (2-3), IDH1 NM_005896.4 (4), IDH2 NM_002168.4 (4), KIT NM_000222.3 (2,8-11,13,17-19), KRAS NM_004985.5 (2-3), MPL NM_005373.3 (10), NOTCH1 NM_017617.5 (26-27,34), NOTCH2 NM_024408.4 (26‐28,34), NPM1 NM_002520.7 (10-11), NRAS NM_002524.5 (2-3), PTPN11 NM_002834.5 (3,7-13), SETBP1 NM_015559.3 (4), SF3B1 NM_012433.4 (10-16), SRSF2 NM_003016.4 (1), STAT3 NM_003150.4 (20-21), STAT5B NM_012448.4 (15‐16), U2AF1 NM_006758.3 (2,6), WT1 NM_000378.6 (5-9). Wir weisen darauf hin, dass somatische Mutationen in den genannten Genen u.U. auch bei Gesunden im Rahmen einer sog. klonalen Hämatopoese (CHIP, potentielle Vorstufe analog zu MGUS) auftreten können und ersuchen daher um Bewertung in Zusammenschau mit Klinik und anderen (Labor)Befunden. Der klinische Impact von Mutationen <10% VAF (zB im Rahmen von subklonalen Tumorpopulationen) ist gegenwärtig noch unklar. Die Bewertung der Ergebnisse ist nur in Zusammenschau mit Immunphänotypisierung, Zytologie sowie anderen histopathologischen Befunden sinnvoll und liegt in der Verantwortung des behandelnden Arztes. Da mit dem eingesetzten Verfahren Keimbahn- und somatische Varianten nicht definitiv unterschieden werden können, kann bei klinischer Indikation eine Keimbahnanalyse mit entsprechender Beratung erforderlich sein.
Prinzip des Verfahrens
Target-Enrichment Next-Generation-Sequencing. Der Workflow des Verfahrens umfasst vier Schritte: 1. Library Herstellung Die Sequencing Library erfolgt durch eine zufällige Fragmentierung der eingesetzten DNA, gefolgt von einer 5‘ und 3‘ Adapter Ligation. Die Adapter-ligierten Fragmente werden anschließend amplifiziert und aufgereinigt. 2. Cluster Generation – Hierfür wir die Library auf eine Flow Cell geladen, wo die Fragmente durch Bindung an komplementäre Oligo-Sequenzen gebunden werden. Jedes Fragment wird sodann amplifiziert und bildet durch Bridge-Amplification einen eigenen klonalen Cluster. 3. Sequenzierung: Durch Zugabe von verschieden Fluoreszenz-markierten Nukleotiden kann pro Sequenzierzyklus (entsprechend der verwendeten Leselänge) der Einbau eines bestimmten Nukleotids in jeden DNA Template Strang in Millionen von Clustern parallel optisch anhand der unterschiedlichen Emissionswellenlängen detektiert und in die entsprechende Base übersetzt werden (sog. Sequencing by synthesis). 4. Daten Analyse Die analysierten Sequenzen werden an die Sequenz des Referenzgenoms angeglichen, wodurch Abweichungen zur Referenzsequenz (SNV, Inseretionen, Deletionen etc.) bioinformatisch nachgewiesen werden können. Anschließend erfolgt die medizinische Interpretation der gefundenen Varianten in Zusammenschau mit internationalen Referenz-Datenbanken.
Literatur
Arber et al. International Consensus Classification of Myeloid Neoplasms and Acute Leukemias: integrating morphologic, clinical, and genomic data. Blood 2022 Sep 15;140(11):1200-1228. Döhner et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2022 recommendations from an international expert panel on behalf of the ELN. Blood 2022 Sep 22;140(12):1345-1377.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
Qualitative Analyse; zu erwartende Ergebnisse: Nachweis / kein Nachweis von SNV/InDels/CNVs in den untersuchten Gen-Regionen
Synonyme
Leukämie-Typisierung molekulargenetisch, AML Typisierung, ALL Typisierung, Lymphom Typisierung, Leukämie Prognosemarker Panel, MDS/MPN Typisierung, CLL Prognosemarker, Mastozytose Typisierung, erweitertes MPE Panel
Analysenfrequenz
wöchentlich
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut; EDTA-Knochenmark
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
pB: 5-10ml, KM: 3ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
nicht zutreffend
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Material unmittelbar nach der Gewinnung gut mit dem jeweiligen Antikoagulans durchmischen (Knochenmarkaspirate sind häufig angeronnen-keine Zellisolierung möglich!), bei externen Einsendung gekühlt (4°C) so rasch als möglich ins ZIMCL transportieren. Die Proben dürfen nicht gefroren und nicht aliquotiert werden. Keine Annahme von Sekundärröhrchen. Laut österreichischem Gentechnikgesetz ist bei Typ I-Untersuchungen KEINE schriftliche Einverständniserklärung zur Durchführung der Genanalyse erforderlich.
Messbereich
Qualitative Analyse; untersuchte Gen-Regionen siehe allg. Beschreibung
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
Schlechte Durchmischung des Knochenmarkaspirates mit dem Antikoagulans sowie generell unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials. Einschränkung des Verfahrens: Größere InDels >130bp, InDels in einer einzelnen Capture-Region, Varianten in Homopolymerregionen (>10bp) oder wenig komplexen Sequenzabschnitten sowie Genfusionen werden nicht gesichert erfasst.
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
nicht zutreffend (sequenzspezifisches Capture-Anreicherung)
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
in house Validierung
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