Beschreibung*
Erfassung der minimalen Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) bei Multiplem Myelom mittels Durchflusszytometrie
Ziel und Zweck der Untersuchung
Das Multiple Myelom war über lange Zeit mit einer sehr schlechten Prognose assoziiert. In den letzten 10 Jahren wurde eine Vielzahl neuer Therapeutika mit unterschiedlichsten Wirkmechanismen entwickelt, wodurch die Überlebensrate von Myelompatienten stark verbessert werden konnte. Leider kommt es bei vielen Patienten trotzdem zu einem Rezidiv der Grundkrankheit, was durch ein Persistieren von Myelomzellen erklärbar ist, die mit herkömmlichen Verlaufsparametern wie Elektrophorese/ Immunfixation, freie Leichtketten oder Plasmazellanteil im Knochenmark bisher nicht erfasst werden konnten. Für ein adäquates Therapiemonitoring und frühzeitiges Erkennen von Rezidiven wurden neue Methoden zur Erfassung einer minimalen Resterkrankung (MRD) entwickelt wie die „Next-generation Flowcytometry“ (NGF). Das Erreichen einer nicht nachweisbaren minimalen Resterkrankung ist mit einem längeren Überleben und somit mit einer besseren Prognose assoziiert, wobei ein cutoff zwischen 10E-4 und 10E-5 für die Definition „MRD negativ“ derzeit vorgeschlagen wird. Eine solche Sensitivitätsgrenze wird mittels NGF erreicht, sofern „Multi-Color-Panels“ mit mindestens 8 Farben angesetzt und mindestens 5 Millionen Zellen akquiriert werden. Zu den Vorteilen der flowzytometrischen Methode gehört die Kosteneffizienz, das zeitnahe Erlangen der Ergebnisse und die Unabhängigkeit von dem initialen Immunphänotyp des Patienten, auch wenn dieser hilfreich sein kann. Auch kann mittels NGF anhand der Erfassung von Mastzellen, B-Vorläuferzellen und Erythropoese eine Aussage über die Qualität des Materials gemacht werden. Die Analyse umfasst folgende Parameter: CD38, CD138, CD45, CD19, CD27, CD56. CD117, CD81, cytKappa, cytLambda.
Prinzip des Verfahrens
Analyse von Einzelzellen in Suspension auf Grundlage von Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften. Antigene (sogenannte CD-Marker = cluster of differentiation) an der Zelloberfläche und im Zellinneren werden durch fluoreszierende Antikörper markiert, durch einen Hüllstrom (Sheath Flüssigkeit) fokussiert und als Einzelzellen an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeführt. Die dadurch emittierten Lichtsignale werden mit Hilfe verschiedener Photomultiplier (PMTs) in elektronische Signale umgewandelt und als Messdaten gespeichert. Zusätzlich wird die Streuung des Anregungslichtes als Forward Scatter (FSC; entspricht der Größe der Zelle) und Side Scatter (SSC; entspricht in etwa der Granularität und Struktur der Zelle) gemessen. An den im ZIMCL eingesetzten Flowzytometern können durch drei verschieden Laser (488nm (blau), 633nm (rot), 405nm (violett)) acht verschiedene Fluorochrome angeregt werden. Durch die Analyse einer Vielzahl von Zellen können bei der anschließenden Auswertung der Daten verschiedene Zellpopulationen definiert werden. Bei der MRD-Analyse werden aus Knochenmarkaspiraten die Leukozytensubpopulationen und Erythropoese relativ zu den Gesamtzellzahl quantifiziert. Durch die Messung von > 1 Million Zellen können Zellpopulationen von 10E-5% erfasst werden.
Literatur
s. Anhang
Ergebniseinheit
%
Einheiten(sonstige)
Absolut-Resultate: gemessene Events; Relativ-Resultate: % der Gesamtzellzahl
Synonyme
FACS-Analyse; Immunologische Zelltypisierung; Next-Generation Flowcytometry
Analysenfrequenz
täglich, außer Wochenende
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24 h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
Knochenmark-Aspirat
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
3-5ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
Knochenmark-Spritze mit Heparin oder EDTA
Spezielle Präanalytik - Probentransport
- Für Analysen aus Knochenmark: Knochenmarkpunktion; Transport durch BMA bzw. Postversand bei Raumtemperatur - Für eine gute Probenqualität sollte immer das erste Knochenmarkaspirat für die MRD Diagnostik verwendet werden! - Es sollten nicht mehr als 3-5 ml Knochenmark aspiriert werden, um einen zu starken Verdünnungseffekt durch Markblut zu vermeiden! - Die Probe sollte max. 24h alt sein. - Die Proben sollten bei Raumtemperatur gelagert werden. - Die Sensitivität kann bei zellarmen Proben geringer sein, da teilweise die maximale Eventzahl einer Messung nicht erreicht wird.
Messbereich
Analyt- und Epitopspezifisch
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
- schlechte Probenqualität durch nicht lysierbare Erythrozyten und hohen Anteil an Zelldebris - alte Probe >24h - verdünntes Material durch Markblut
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
unspezifische Bindung der Antikörper möglich, oft patientenspezifisch
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
Analyse-Gerät, Reagenzien und Antikörper CE-IVD-zertifiziert
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