Beschreibung*
Erfassung der minimalen Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) bei akuter Vorläufer B-lymphatischer Leukämie (ALL) mittels Durchflusszytometrie
Ziel und Zweck der Untersuchung
Die akute lymphatische Leukämie ist eine maligne hämatologische Erkrankung mit einem Häufigkeitsgipfel im Kindesalter. Die Gesamtinzidenz liegt bei 1/100000 pro Jahr, bei Kindern bei 5/100000 pro Jahr (ÖGHO Leitlinien). In der Diagnostik der ALL spielt die Flowzytometrie eine zentrale Rolle, insbesondere für die Bestimmung der Zelllinienzugehörigkeit und der Erfassung von eventuellen Subpopulationen bei Erstdiagnose. Der Nachweis einer minimalen Resterkrankung (MRD = minimal residual disease) während und nach einer Therapie wird als einer der stärksten prognostischen Faktoren bei ALL angesehen. Die MRD-Messung spielt eine bedeutende Rolle in der Beurteilung eines Therapieansprechens, dem frühen Erkennen von Rezidiven und in der Entscheidung für weitere Therapien, insbesondere der Stammzelltransplantation. Je nach Zeitpunkt der MRD-Bestimmung variiert die prognostische Aussage: eine MRD-Negativität nach Induktionstherapie bedeutet ein niedriges Relapse-Risiko, während eine nachweisbare MRD am Ende der Konsolidierungstherapie mit einer schlechten Prognose korreliert. Zu den Methoden der MRD-Messungen gehört die „Next-Generation Flowcytometry“ (NGF), deren Vorteile gegenüber molekularbiologischen Methoden die Kosteneffizienz, das zeitnahe Erlangen der Ergebnisse und die relative Unabhängigkeit von dem initialen Immunphänotyp des Patienten sind, auch wenn dieser hilfreich sein kann. Mittels NGF kann durch die Anwendung von Multi-Color-Panels und der Akquirierung von >5 Millionen Zellen eine Sensitivitätsgrenze von <10E-5 erreicht werden. Die ÖGHO Leitlinie für ALL bei Erwachsenen gibt eine Sensitivitätsgrenze von 0,01% für das Erlangen einer molekularen Response an. Im ZIMCL wird der nach dem EuroFlow Konsortium standarisierte Ansatz der MRD Messung bei akuter Vorläufer B-lymphatischer Leukämie (ALL) angewandt. Es werden folgende Parameter analysiert: CD19, CD20, CD81, CD34, CD10, CD38, CD45, CD66c, CD123, CD304, CD73.
Prinzip des Verfahrens
Analyse von Einzelzellen in Suspension auf Grundlage von Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften. Antigene (sogenannte CD-Marker = cluster of differentiation) an der Zelloberfläche und im Zellinneren werden durch fluoreszierende Antikörper markiert, durch einen Hüllstrom (Sheath Flüssigkeit) fokussiert und als Einzelzellen an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeführt. Die dadurch emittierten Lichtsignale werden mit Hilfe verschiedener Photomultiplier (PMTs) in elektronische Signale umgewandelt und als Messdaten gespeichert. Zusätzlich wird die Streuung des Anregungslichtes als Forward Scatter (FSC; entspricht der Größe der Zelle) und Side Scatter (SSC; entspricht in etwa der Granularität und Struktur der Zelle) gemessen. An den im ZIMCL eingesetzten Flowzytometern können durch drei verschieden Laser (488nm (blau), 633nm (rot), 405nm (violett)) acht verschiedene Fluorochrome angeregt werden. Durch die Analyse einer Vielzahl von Zellen können bei der anschließenden Auswertung der Daten verschiedene Zellpopulationen definiert werden. Bei der MRD-Analyse werden aus Knochenmarkaspiraten die Leukozytensubpopulationen und Erythropoese relativ zu den Gesamtzellzahl quantifiziert. Durch die Messung von > 1 Million Zellen können Zellpopulationen von 10E-5% erfasst werden.
Literatur
s. Anhang
Ergebniseinheit
%
Einheiten(sonstige)
Absolut-Resultate: gemessene Events; Relativ-Resultate: % der Gesamtzellzahl
Synonyme
FACS-Analyse; Immunologische Zelltypisierung; Next-Generation Flowcytometry
Analysenfrequenz
täglich, außer Wochenende
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24 h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
Knochenmark-Aspirat
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
3-5ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
Knochenmark-Spritze mit Heparin oder EDTA
Spezielle Präanalytik - Probentransport
- Knochenmarkpunktion; Transport durch BMA bzw. Postversand bei Raumtemperatur - Für eine gute Probenqualität sollte immer das erste Knochenmarkaspirat für die MRD Diagnostik verwendet werden! - Es sollten nicht mehr als 3-5 ml Knochenmark aspiriert werden, um einen zu starken Verdünnungseffekt durch Markblut zu vermeiden! - Die Probe sollte max. 24h alt sein. - Die Proben sollten bei Raumtemperatur gelagert werden. - Die Sensitivität kann bei zellarmen Proben geringer sein, da teilweise die maximale Eventzahl einer Messung nicht erreicht wird.
Messbereich
Analyt- und Epitopspezifisch
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
- schlechte Probenqualität durch nicht lysierbare Erythrozyten und hohen Anteil an Zelldebris - alte Probe >24h - verdünntes Material durch Markblut
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
unspezifische Bindung der Antikörper möglich, oft patientenspezifisch
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
Analyse-Gerät, Reagenzien und Antikörper CE-IVD-zertifiziert
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