Beschreibung*
Immunophänotypisierung von Zellen des peripheren Blutes zur PNH-Analyse mittels hochsensitiver Durchflusszytometrie
Ziel und Zweck der Untersuchung
Die Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) ist eine klonale hämatopoetische Stammzellerkrankung verursacht durch eine erworbene somatische Mutation im PIG-A Gen. Dieses Gen ist notwendig für die Biosynthese von Glykosylphosphatidylinositol (GPI), einem Ankerprotein für eine Vielzahl von membranständigen Proteinen. PNH-Stammzellen und die weiter differenzierten PNH-Zellen präsentieren sich mit einem partiellen oder kompletten Verlust des GPIs, was pathognomonisch für die PNH ist und für die klinischen Manifestationen verantwortlich ist. Der Verlust dieser Schutzantigene macht die Zelle sensibel für das eigne Komplementsystem und führt somit zu der für die PNH-Erkrankung charakteristische Symptomatik: hämolytischer Anämie, thrombotische Ereignisse (oft an atypischen Lokalisationen), hämatopoetische Insuffizienz, abdominelle Schmerzen, ösophageale Spasmen, erektile Dysfunktion und Niereninsuffizienz. Ein PNH-Klon kann isoliert oder in Zusammenhang mit anderen hämatopoetischen Erkrankungen wie Aplastischer Anämie oder MDS auftreten. Der immunphänotypische Nachweis des Verlustes an GPI-verankerten Antigenen oder des GPI-Ankers selbst (mittels FLAER) ist der Goldstandard der PNH-Diagnostik. Die Diagnose PNH gilt gesichert mit der sogenannten „2x2 Regel“. - Bei mind. 2 Zellreihen (Erythrozyten/ Retikulozyen, Granulozyten oder Monozyten) liegt eine GPI-defiziente Population vor. - Auf jeder Zellreihe müssen mind. zwei GPI-verankerte Marker untersucht werden und defizient sein. Die Analyse umfasst folgende Parameter: Leukozyten; neutrophile Granulozyten (CD15+/CD64-), Monozyten (CD15-/CD64+), Erythrozyten, Retikulozyten (RetiCount). PNH-Zellen werden mit folgenden Antikörpern erfasst: FLAER CD157, CD59, CD55. Indikationen: - erworbene, Coombs-negative hämolytische Anämie - intravasale Hämolyse - Thrombosen - Diagnose / dringender V.a. aplastische Anämie - Diagnose / dringender V.a. myelodysplastisches Syndro - rez. auftretende abdominelle Schmerzkrisen unklarer Genese
Prinzip des Verfahrens
Analyse von Einzelzellen in Suspension auf Grundlage von Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften. Antigene (sogenannte CD-Marker = cluster of differentiation) an der Zelloberfläche und im Zellinneren werden durch fluoreszierende Antikörper markiert, durch einen Hüllstrom (Sheath Flüssigkeit) fokussiert und als Einzelzellen an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeführt. Die dadurch emittierten Lichtsignale werden mit Hilfe verschiedener Photomultiplier (PMTs) in elektronische Signale umgewandelt und als Messdaten gespeichert. Zusätzlich wird die Streuung des Anregungslichtes als Forward Scatter (FSC; entspricht der Größe der Zelle) und Side Scatter (SSC; entspricht in etwa der Granularität und Struktur der Zelle) gemessen. An den im ZIMCL eingesetzten Flowzytometern können durch drei verschieden Laser (488nm (blau), 633/638nm (rot), 405nm (violett)) 8-10 verschiedene Fluorochrome angeregt werden. Durch die Analyse einer Vielzahl von Zellen können bei der anschließenden Auswertung der Daten verschiedene Zellpopulationen definiert werden. Bei der PNH handelt es sich um negative Populationen für die entsprechenden Antikörper.
Literatur
s. Anhang
Ergebniseinheit
%
Einheiten(sonstige)
Relativ-Resultate: % der neutrophilen Granulozyten, Monozyten, Erythrozyten und Retikulozyten
Synonyme
FACS-Analyse; Immunologische Zelltypisierung; Immunphänotypisierung
Analysenfrequenz
täglich, außer Wochenende
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24 h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
Nativblut mit K-EDTA
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
500 µl
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Für Analysen aus peripherem Blut: Venenpunktion oder kapilläre Abnahme; Transport über Rohrpost bzw. Postversand bei Raumtemperatur
Messbereich
Analyt- und Epitopspezifisch
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
Normoblasten; Makroplättchen; Megakaryozyten; Lyse-resistente Erythrozyten; GPI-negative Zellen ohne PNH-Klon
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
unspezifische Bindung der Antikörper möglich, oft patientenspezifisch
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
Analyse-Gerät, Reagenzien und Antikörper CE-IVD-zertifiziert
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