Beschreibung*
Nachweis des IGHV Hypermutations-Status aus Vollblut oder Knochenmark mittels Next-Generation-Sequencing (NGS)
Ziel und Zweck der Untersuchung
Seit den 90er Jahren ist bekannt, dass Immunglobulin (IG)-Rezeptoren und Antigenstimulationen in der Entstehung der chronisch lymphatischen Leukämie (CLL) eine wesentliche Rolle spielen. In mehreren Studien zeigte sich eine ausgeprägte Verzerrung des Immunglobulin-Genrepertoires bei CLL-Zellen sowie das Vorhandensein von somatischer Hypermutation (SHM) innerhalb der neu arrangierten variablen Immunglobulin Schwerketten Gene (IG Heavy Variable / IGHV) des klonotypischen B-Zell-Rezeptors (BcR). Dadurch lässt sich die CLL in zwei große Kategorien unterteilt: Die erste beinhaltet Fälle ohne oder mit begrenzter SHM ("nicht mutierte" CLL, U-CLL), während die zweite Kategorie Fälle mit einem signifikanten SHM-Anteil ("mutierte" CLL, M-CLL) beinhaltet. Bemerkenswert ist, dass der IGHV-Mutationsanteil eine gute Vorhersage des klinischen Verlaufs der Erkrankung auf der Grundlage des SHM-Status innerhalb der exprimierten IGHV-Gene ermöglicht. So unterscheidet sich bei Patienten mit U-CLL nicht nur der klinische Verlauf, sondern auch die biologischen Eigenschaften deutlich von Patienten mit M-CLL. Ein nicht-mutierter SHM Status (U-CLL) ist mit anderen, prognostisch negativen genomischen Aberrationen, kürzerer Progressionszeit sowie einem insgesamt schlechteren Outocme im Vergleich zu einem mutierten SHM Status (M-CLL) assoziiert. Der Cut-Off zur Unterscheidung von IG-mutiert vs. IG-unmutiert liegt gemäß ERIC-Empfehlungen bei 98% Übereinstimmung mit der Keimbahn-Sequenz (bzw. 2% Sequenzunterschied). Ein nicht-mutierter IGHV-Status liegt bei <2%, ein mutierter IGHV-Status bei >2% Sequenzunterschied vor. Die Bedeutung eines grenzwertig mutierten IGHV-Status (2-3% Sequenzunterschied) ist derzeit noch nicht gänzlich geklärt.
Prinzip des Verfahrens
Target-Enrichment Next-Generation-Sequencing. Der Workflow des Verfahrens umfasst vier Schritte: 1. Library Herstellung Multiplex PCR mit Primerbindestellen in der Leader (VHL) und der Joining (J) IGH Region. PCR-Primersequenzen inkludieren die Illumina Adapter und Indices für die Sequenzierung. Die Amplifikate werden anschließend gereinigt, quantifiziert und äquimolar zu einer library gepoolt. 2. Cluster Generation – Hierfür wir die Library auf eine Flow Cell geladen, wo die Fragmente durch Bindung an komplementäre Oligo-Sequenzen gebunden werden. Jedes Fragment wird sodann amplifiziert und bildet durch Bridge-Amplification einen eigenen klonalen Cluster. 3. Sequenzierung: Durch Zugabe von verschieden Fluoreszenz-markierten Nukleotiden kann pro Sequenzierzyklus (entsprechend der verwendeten Leselänge) der Einbau eines bestimmten Nukleotids in jeden DNA Template Strang in Millionen von Clustern parallel optisch anhand der unterschiedlichen Emissionswellenlängen detektiert und in die entsprechende Base übersetzt werden (sog. Sequencing by synthesis). 4. Daten Analyse Die bioinformatische Spezialsoftware berechnet die Mutationsrate (SHM) basierend auf die % Abweichungen der Sequenz der klonalen Amplikone gegenüber der entsprechenden Keimbahnreferenzgensequenz.
Literatur
•Langerak, A. W. et al., (2011) Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases. Leukemia 25, 979–984. •Tonegawa, S. (1983). Somatic Generation of Antibody Diversity. Nature 302, 575–581. •Ghia, P. et al., (2007). ERIC recommendations on IGHV gene mutational status in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 21, 1–3. •Trainor, KJ. et al., (1990). Monoclonality in B-lymphoproliferative disorders detected at the DNA level. Blood 75, 2220–2222. •Miller, J. E. (2013). Principle of Immunoglobulin and T Cell Receptor Gene Rearrangement. In Cheng, L., Zhang, D., Eble, J. N. (Eds), Molecular Genetic Pathology (2nd Ed., sections 30.2.7.13 and 30.2.7.18). New York, USA: Springer Science & Business Media. •Davi, F. et al., (2008). Determination of IGHV gene mutational status in chronic lymphocytic leukemia: bioinformatics advances meet clinical needs. Leukemia 22, 212-214. •Ghia, P. et al., (2005). Geographic patterns and pathogenetic implications of IGHV gene usage in chronic lymphocytic leukemia: the lesson of the IGHV3-21 gene. Blood 105, 1678-1685.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
Mutierter IGHV-Status (M-CLL, >2% Sequenzunterschied), grenzwertig mutierter IGHV-Status (Borderline M-CLL, 2-3% Sequenzunterschied), unmutierter IGHV-Status (U-CLL, <2% Sequenzunterschied) nachgewiesen
Synonyme
IGHV Somatische Hypermutation SHM Status IGHV Rearrangement IGHV Leader CLL Prognosemarker ERICLL
Analysenfrequenz
1x monatlich
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
12 Stunden
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut; Knochenmark
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
pB: 5-10ml, KM: 3ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
Heparin-KM
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Material unmittelbar nach der Gewinnung gut mit dem jeweiligen Antikoagulans durchmischen (Knochenmarkaspirate sind häufig angeronnen-keine Zellisolierung möglich!). Bei externer Einsendung auf 4 Grad stellen und rasch ins ZIMCL transportieren. Die Proben dürfen nur gekühlt und nicht gefroren werden. Nicht aliquotieren. Keine Annahme von Sekundärröhrchen! Laut österreichischem Gentechnikgesetz ist bei Typ I-Untersuchungen KEINE schriftliche Einverständniserklärung zur Durchführung der Genanalyse erforderlich.
Messbereich
Qualitative Analyse; untersuchte Gen-Regionen siehe allg. Beschreibung
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
- Schlechte Durchmischung des Knochenmarkaspirates mit dem Antikoagulans - generell unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
nicht zutreffend (sequenzspezifische Amplifikation der untersuchten Loci)
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
CE-IVD
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