Beschreibung*
Quantitativer molekularer Nachweis von BCR-ABL1 µ-bcr (p230) aus isolierten Gesamtleukozyten (Erythrozytenlyse Vollblut) mittels ddPCR.
Ziel und Zweck der Untersuchung
Die chronische myeloische Leukämie, ist eine klonale myeloproliferative Entartung der pluripotenten Stammzelle des Knochenmarks, die eine exzessive Produktion von transformierten primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen sowie eine myeloide Hyperplasie im Knochenmark zur Folge hat. In 95% der Fälle ist diese maligne Entartung durch eine spezifische zytogenetische Abnormität, die sog. Philadelphia-Translokation bedingt. Neben dieser Form, der klassischen CML, tritt bei den restlichen 5% die atypische CML auf, welche alternative Translokationen, z.T. unter Miteinbeziehung anderer Chromosomen, aufweist. Kausal für die Entstehung der CML ist das Auftreten der Philadelphia-Translokation. Neben bei der CML tritt diese spezifische Abnormität auch bei 15-20% der erwachsenen AML Patienten auf. Als Philadelphia Chromosom wird das verkürzte Chromosom 22 bezeichnet, welches durch eine reziproke Translokation zwischen den langen Armen der Chromosome 22 und 9 entsteht. Je nachdem, wo der Bruchpunkt im BCR-Gen ist, kann das Fusionsprotein unterschiedliche Größen (zwischen 185 und 230 kd) annehmen. Mögliche Produkte sind das p190, p210 und in sehr seltenen Fällen das p230 BCR-ABL Protein (sog. minor, major und µ-Bruchpunkt), wobei die biologische Aktivität der Kinase mit zunehmender Größe abnimmt. Die am häufigsten nachweisbare Form ist das p210 (>95% d.F.). Mit der molekularen Quantifizierung des BCR-ABL Transkripts kann der Grad des molekularen Ansprechens evaluiert werden; die Ergebnisse können für die Verlaufsbeobachtung der minimalen Resterkrankung (MRD = minimal residual disease) verwendet werden.
Prinzip des Verfahrens
Das digital droplet PCR-System (ddPCR) beruht auf der Partitionierung eines konventionellen PCR-Ansatzes in bis zu 20.000 Einzelreaktionen (im ZIMCL verwendete Methode: Partitionierung mittels Wasser-Öl-Emulsion). Für gewöhnlich enthält man Partitionen, die eine oder mehrere Kopien der Ziel-DNA sowie Partitionen, die keine Ziel-DNA enthalten. Anschließend wird eine Endpunkt-PCR (z. B. mit Hydrolysesonden) und eine Detektion der Amplifikation für jedes Kompartiment durchgeführt, sodass sich ein positives (1) oder negatives (0) Signal für jede einzelne Partition ergibt. Diese 0/1-Antworten führten zu der Bezeichnung „digitale PCR“. Die Rohdaten werden dann mittels Poisson-Statistik analysiert und die absolute DNA-Ausgangskopienzahl in der Originalprobe bestimmt. Ein großer Vorteil der ddPCR liegt in der absoluten Quantifizierung von Zielgenen, d.h. eine Quantifizierung ohne Verwendung einer externen Kalibration, z.B. einer Standardkurve. Der zweite große Vorteil der ddPCR ist die Detektion von Mutationen mit geringem allelischen Anteil, die vor allem in der Krebsdiagnostik eine wichtige Rolle spielen. Bei der konventionellen qPCR-Analyse liegt das Hintergrundsignal (Kopienzahl) des Wildtyp-Allels oftmals deutlich über dem der Mutation, sodass eine Detektion der Mutation schwierig ist. Durch die Partitionierung bei der ddPCR wird das Hintergrundsignal des Wildtyps jedoch reduziert und die Mutation innerhalb der Partition aufkonzentriert. Der Nachweis von solchen raren Mutationen spielt v.a. in der MRD-Diagnostik (Minimal Residual Disease, Verlaufskontrollen bei hämatoonkologischen Erkrankungen) eine ausschlaggebende Rolle. In der ddPCR werden die gleichen Reagenzien und Arbeitsabläufe wie in den meisten Standard TaqMan –Hydrolyseprobe-basierenden PCR-Ansätzen verwendet. Der quantitative Nachweis erfolgt somit mittels spezifischer Sonden für das BCR-ABL p230 Fusionstranskript sowie für das ABL1 Kontrollgen-Transkript, woraus eine normalisierte und nach internationalem Standard berechnete BCRABL-pro-ABL Copynummer errechnet wird.
Literatur
- Beillard, E. et al Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) – a Europe against cancer program. Leukemia (2003) 17, 2474. - White, H.E. et al. (2010) Establishment of the first World Health Organization International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR-ABL mRNA. Blood 116, e111. - van der Velden, V.H., Hochhaus, A., Cazzaniga, G., Szczepanski, T., Gabert, J., and van Dongen, J.J. (2003) Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. Leukemia 17, 1013. - Gabert, J. et al. (2003) Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia — a Europe Against Cancer program. Leukemia 17, 2318. - Baccarani, M. et al. (2006) Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood 108, 1809. - Baccarani, M. et al. (2009) Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. J. Clin. Oncol. 27, 6041. - Branford, S. et al. (2006) Rationale for the recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts in patients with chronic myeloid leukaemia. Leukemia 20, 1925. - Branford, S. et al. (2008) Desirable performance characteristics for BCR-ABL measurement on an international reporting scale to allow consistent interpretation of individual patient response and comparison of response rates between clinical trials. Blood 112, 3330. - Hughes, T. et al. (2006) Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 108, 28.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
NCN = BCRABL / ABL %
Synonyme
p230, BCR-ABL MRD, CML Monitoring, BCR-ABL Monitoring, Minimal Residual Disease
Analysenfrequenz
b.B.
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24 h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut, Knochenmark
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
10 ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
nicht zutreffend
Spezielle Präanalytik - Probentransport
INTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG mittels ROHRPOST INS ZIMCL einsenden EXTERN: EDTA Blut bzw. Knochenmarkaspirat SOFORT NACH GEWINNUNG kühlen (2-8°C) und mit COOLPACKS innerhalb von 24h ins ZIMCL versenden. Der rasche, gekühlte Transport ist bei Verlauspatienten UNBEDINGT ERFORDERLICH. Die Proben dürfen nur GEKÜHLT und NICHT EINGEFROREN werden.
Messbereich
BCR-ABL NCN >0,027 bei zumindest 18.000 ABL1 Kopien, >0,0166 bei zumindest >30.000 ABL1 Kopien, >0,0090 bei zumindest >50.000 ABL1 Kopien
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
•Heparin als Antikoagulans kann die PCR stören •Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
keine
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
in-house Methode
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