Parameterdetails

Parametername: Flowzytometrie, MRD CLL

Version: 1 Gültig ab 03.06.2024

Beschreibung* Erfassung der minimalen Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) bei chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) mittels Durchflusszytometrie

Ziel und Zweck der Untersuchung Die CLL (Chronische lymphatische Leukämie) ist ein indolentes B-Zell-Lymphom, das durch einen leukämischen Verlauf charakterisiert ist und gehört zu den häufigsten leukämischen Erkrankungen in Mitteleuropa. Zu den diagnostischen Kriterien der CLL zählt neben einer Mindestzellzahl klonaler B-Zellen von 5000/µl über 3 Monate und der charakteristischen Morphologie von reifen, kleinen, grobscholligen Lymphozyten auch die Flowzytometrie. Durchflusszytomerisch erfolgt der Klonalitätsnachweis anhand der Leichtkettenrestriktion sowie dem Nachweis des folgenden typischen Markerprofils: CD19+, CD20 w+, CD5+, kappa/lambda w+, CD23+, CD43+, CD79b w+, CD200+, CD81 w+.
Therapeutische Maßnahmen sind erst beim Auftreten von Symptomen initiiert, wobei in den letzten Jahren eine Reihe neuer, vielversprechender Medikamente gegen spezifischen Targets (small molecule inhibitors) auf den Markt gekommen sind. Die MRD-Messung gilt als unabhängiger Vorhersagewert bezüglich des Outcomes (OS und PFS) nach Therapie und kann insbesondere bei den neuen Therapieansätzen als Surrogatmarker für dessen Effektivität verwendet werden.
Neben molekularbiologischen Methoden ist die Flowzytometrie eine kostengünstige und schnelle Methode für die MRD-Messung. Bei dem „International Workshop on CLL Guidelines 2008“ wurde ein Threshold von <10E-4 (0,01% bzw. 1 pathologische Zelle in 10 000 Zellen) für „MRD negativ“ festgelegt. Rawston et.al. konnte mit einem 6-Farben-Panel auf eine Sensitivität von 10E-5 erreichen und passte gut mit den molekularbiologischen Messungen zusammen.

Im ZIMCL wird der nach dem EuroFlow Konsortium standarisierte Ansatz der MRD Messung angewandt und
entsprechend der ERIC-Empfehlungen folgende Parameter analysiert: CD19, CD20, CD81, CD5, CD43, CD79b, CD2, CD10, CD45.

Prinzip des Verfahrens Analyse von Einzelzellen in Suspension auf Grundlage von Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften. Antigene (sogenannte CD-Marker = cluster of differentiation) an der Zelloberfläche und im Zellinneren werden durch fluoreszierende Antikörper markiert, durch einen Hüllstrom (Sheath Flüssigkeit) fokussiert und als Einzelzellen an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeführt. Die dadurch emittierten Lichtsignale werden mit Hilfe verschiedener Photomultiplier (PMTs) in elektronische Signale umgewandelt und als Messdaten gespeichert. Zusätzlich wird die Streuung des Anregungslichtes als Forward Scatter (FSC; entspricht der Größe der Zelle) und Side Scatter (SSC; entspricht in etwa der Granularität und Struktur der Zelle) gemessen.
An den im ZIMCL eingesetzten Flowzytometern können durch drei verschieden Laser (488nm (blau), 633nm (rot), 405nm (violett)) acht verschiedene Fluorochrome angeregt werden.
Durch die Analyse einer Vielzahl von Zellen können bei der anschließenden Auswertung der Daten verschiedene Zellpopulationen definiert werden.
Bei der MRD-Analyse werden aus periph. Blut oder Knochenmarkaspiraten die Leukozytensubpopulationen und Erythropoese relativ zu den Gesamtzellzahl quantifiziert. Durch die Messung von > 1 Million Zellen können Zellpopulationen mit einer Sensitivität von ≤10E-5% erfasst werden.

Literatur s. Anhang

Ergebniseinheit %

Einheiten(sonstige) Absolut-Resultate: gemessene Events; Relativ-Resultate: % der Gesamtzellzahl

Synonyme FACS-Analyse; Immunologische Zelltypisierung;
Next-Generation Flowcytometry

Analysenfrequenz täglich, außer Wochenende

Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage) 24 h

Spezimen
(Plasma, Serum, Harn) Knochenmark-Aspirat, periph. Blut

Sammelperiode nicht zutreffend

Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation) 3-5ml

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe K-EDTA Monovette

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige) Knochenmark-Spritze mit Heparin oder EDTA

Spezielle Präanalytik - Probentransport - mind. 3-5ml EDTA-Blut, bei niedriger Leukozytenzahl mehr bzw. 2 Röhrchen
- Knochenmarkpunktion; Transport durch BMA bzw. Postversand bei Raumtemperatur
- Für eine gute Probenqualität sollte immer das erste Knochenmarkaspirat für die MRD Diagnostik verwendet werden!
- Es sollten nicht mehr als 3-5 ml Knochenmark aspiriert werden, um einen zu starken Verdünnungseffekt durch Markblut zu vermeiden!
- Die Probe sollte max. 24h alt sein.
- Die Proben sollten bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Die Sensitivität kann bei zellarmen Proben geringer sein, da teilweise die maximale Eventzahl einer Messung nicht erreicht wird.

Messbereich Analyt- und Epitopspezifisch

Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie) - schlechte Probenqualität durch nicht lysierbare Erythrozyten und hohen Anteil an Zelldebris
- alte Probe >48h
- verdünntes KM-Material durch Markblut

Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch) unspezifische Bindung der Antikörper möglich, oft patientenspezifisch

Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR Analyse-Gerät, Reagenzien und Antikörper CE-IVD-zertifiziert

Erklärung nach IVDR 2017/746
(für in-house Methoden) ERKLÄRUNG nach Art. 5 (5) der EU-Verordnung über In-vitro-Diagnostika (EU) 2017/746 (IVDR) zur Eigenherstellung eines IVD in Gesundheitseinrichtungen:

Wir erklären in alleiniger Verantwortung, dass das unten angeführte Produkt, welches im Wege der Eigenherstellung von uns hergestellt wird, allen Anforderungen der IVD-Verordnung (EU) 2017/746, Anhang I Grundlegende Sicherheits- und Leistungsanforderungen, entspricht, die anwendbar sind:

Das Produkt wurde in unseren eigenen Räumlichkeiten von uns in nicht industriellem Maßstab gefertigt und wird ausschließlich in unserer Gesundheitseinrichtung betrieben.

Gesundheitseinrichtung: Tirol Kliniken, Anichstr. 35, 6020 Innsbruck
Geschäftsführer: Mag. Stefan Deflorian
Leiter Qualitätsmanagement: Martin Weichselbraun, MSc.

Produktname: Flowzytometrie, MRD CLL

Ort und Datum der Erstellung: Innsbruck, am: 27.10.2020

Produktklassifizierung nach Anhang VIII: Klasse: Klasse C

Ausdruck gültig am 06.02.2025

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