Beschreibung*
Gen-Sequenzanalyse von DNA aus peripherem Blut oder Knochenmarkaspirat mittels Sanger-Sequenzierung
Ziel und Zweck der Untersuchung
Die klassische Sequenzierung mit der Methode nach Sanger (Kettenabbruch-Sequenzierung) ist seit vielen Jahren in der Diagnostik in Verwendung und gilt nach wie vor als diagnostischer Goldstandard hinsichtlich Richtigkeit der Ergebnisse. Im Gegensatz zur PCR kann bei Sanger-Sequenzierung nicht nur nach konkreten definierten Mutationen (zB häufige Punktmutationen, kleine Insertionen/Deletionen) in bestimmten Genabschnitten gesucht sondern es können auch unbekannte Abweichungen der primären linearen Basenabfolge eines DNA-Abschnittes (einzelne bis mehrere Nukleotide) nachgewiesen werden. Für die Sequenzierung von größeren Genabschnitten bzw. mehreren Genen gleichzeitig oder zum Nachweis von somatischen subklonalen Mutationen sind seit kurzem alternativ auch Hochdurchsatz Sequenzierverfahren (NGS) verfügbar.
Prinzip des Verfahrens
Während der Sequenzier (Cycle Sequencing)-Reaktion führt der Einbau eines fluoreszenzmarkierten dd(didesoxy)NTP zum Abbruch der Polymerisations-reaktion. Durch diese Kettenabbrüche entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die am Ende jeweils mit einem von vier Fluoreszenzfarbstoffen (je nach eingebauter Base am Strangende) markiert sind. Die entstehenden Kettenabbruchprodukte werden mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz angeregt. Das Chromatogramm (die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen) gibt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder.
Literatur
F. Sanger et al.: Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA. In: Nature. Band 265, 1977, S. 687–695. F. Sanger et al.: DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. In: Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. Band 74, 1977, S. 5463–5467. F. Sanger, A. R. Coulson: A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. In: Journal of Molecular Biology. Band 93, 1975, S. 441–448.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
nicht zutreffend (qualitative Analyse)
Synonyme
Gensequenzierung Sangersequenzierung DNA-Sequenzierung cDNA-Sequenzierung
Analysenfrequenz
nach Anforderung
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
24h
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
EDTA-Vollblut, EDTA-Knochenmarkaspirat
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
2 ml
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
K-EDTA Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
nicht zutreffend
Spezielle Präanalytik - Probentransport
Probenanlieferung bei 2-8°C, nicht frieren, nicht aliquotieren. Keine Annahme von Sekundärröhrchen!
Messbereich
Qualitative Analyse; zu erwartende Ergebnisse: Keine Abweichung von der Referenzsequenz oder Punktmutation, Insertion/Deletion <185bp nachgewiesen.
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
• Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials • Die Aussagekraft bei der Erfassung von Mosaikbefunden <10% ist begrenzt. • Insertionen/Deletionen außerhalb das validierten Bereichs (>185bp) werden nicht zuverlässig erfasst • Strukturelle oder numerische Chromosomenveränderungen (Inversionen, Translokationen, Mikrodeletionen/Duplikationen, Trisomien etc), Dosisveränderungen (Deletionen/Duplikationen einzelner Exone oder des gesamten Gens) sowie Varianten in regulatorischen Regionen außerhalb der analysierten Bereiche werden mit der Sanger-Sequenzierung nicht erfasst.
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
nicht zutreffend
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
in-House Leistungsbewertung
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