Beschreibung*
Nachweis der KRAS G12C Mutation aus Plasma-DNA, Vollblut oder Knochenmarkaspirat mittels ddPCR
Ziel und Zweck der Untersuchung
KRAS, ein Mitglied der RAS-Superfamilie, ist ein wichtiger Regulator von Signalwegen, die für die Zellproliferation, Differenzierung und Überleben von Zellen verantwortlich ist. KRAS ist ein häufig mutiertes Onkogen bei menschlichen Tumorerkrankungen. Mutationen im KRAS Gen können zu einer kontinuierlichen Zellproliferation und Tumorentstehung führen. Die KRAS-G12C-Mutation tritt bei etwa 13% der NSCLC-Patienten und bei 1 bis 3% der kolorektalen und anderen soliden Tumoren auf. G12C ist eine Punktmutation (SNV) durch einen Glycin>Cystein Austausch am Codon 12. Diese Substitution begünstigt den aktivierten Zustand von KRAS und verstärkt Signalwege, die zur Onkogenese führen. In ersten Studien konnte gezeigt werden, dass eine spezifische Hemmung durch Sotorasib eine effektive Option für KRAS-G12C-Patienten darstellt. Aus diesem Grund wird gemäß NCCN-Leitlinien die Untersuchung auf KRAS G12C bei allen in Frage kommenden Patienten mit fortgeschrittenem NSCLC empfohlen. Die Bestimmung des G12C Mutationsstatus aus zellfreier DNA (cfDNA) im Sinne einer Liquid Biopsy ist ein wertvolles Instrument zur Überwachung der zeitlichen Tumordynamik. Mit der jüngsten Entwicklung von mehrerer KRAS-G12C-Inhibitoren gewinnt der KRAS-Mutationsstatus bei fortgeschrittenem NSCLC daher zunehmend an prädiktiver Bedeutung.
Prinzip des Verfahrens
Das digital droplet PCR-System (ddPCR) beruht auf der Partitionierung eines konventionellen PCR-Ansatzes in vielen Einzelreaktionen (im ZIMCL verwendete Methode: Partitionierung mittels Wasser-Öl-Emulsion). Für gewöhnlich enthält man Partitionen, die eine oder mehrere Kopien der Ziel-DNA sowie Partitionen, die keine Ziel-DNA enthalten. Anschließend wird eine Endpunkt-PCR (z. B. mit Hydrolysesonden) und eine Detektion der Amplifikation für jedes Kompartiment durchgeführt, sodass sich ein positives (1) oder negatives (0) Signal für jede einzelne Partition ergibt. Diese 0/1-Antworten führten zu der Bezeichnung „digitale PCR“. Die Rohdaten werden dann mittels Poisson-Statistik analysiert und die absolute DNA-Ausgangskopienzahl in der Originalprobe bestimmt. Ein großer Vorteil der ddPCR liegt in der absoluten Quantifizierung von Zielgenen, d.h. eine Quantifizierung ohne Verwendung einer externen Kalibration, z.B. einer Standardkurve. Der zweite große Vorteil der ddPCR ist die Detektion von Mutationen mit geringem allelischen Anteil, die vor allem in der Krebsdiagnostik eine wichtige Rolle spielen. Bei der konventionellen qPCR-Analyse liegt das Hintergrundsignal (Kopienzahl) des Wildtyp-Allels oftmals deutlich über dem der Mutation, sodass eine Detektion der Mutation schwierig ist. Durch die Partitionierung bei der ddPCR wird das Hintergrundsignal des Wildtyps jedoch reduziert und die Mutation innerhalb der Partition aufkonzentriert. Der Nachweis von solchen raren Mutationen spielt v.a. in der MRD- und der molekularen Tumormarker-Diagnostik (eine ausschlaggebende Rolle. In der ddPCR werden die gleichen Reagenzien und Arbeitsabläufe wie in den meisten Standard TaqMan –Hydrolyseprobe-basierenden PCR-Ansätzen verwendet. Beim Nachweis der KRAS G12C Mutation kommt die allelspezifische PCR-Technologie zum Einsatz, die einen empfindlichen, genauen und hoch reproduzierbaren Nachweis der SNPs ermöglicht. Nur bei einer perfekten Übereinstimmung zwischen Sonden und Target-DNA kommt es bei der Extension in der PCR zu einer Hydrolyse der Sonde und somit zur Detektion eines Fluoreszenzsignals.
Literatur
NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines®) for Non-Small Cell Lung Cancer v.5.2021. Kalemkerian GP, et al. J Clin Oncol. 2018;36:911-919. McGranahan N, et al. Sci Transl Med. 2015;7:283ra54. Lindeman NI, et al. Arch Pathol Lab Med. 2018;142:321-346. Leighl NB, et al. Clin Cancer Res. 2019;25:4691-4700. Sherwood JL, et al. ESMO Open. 2017;2:e000235.
Ergebniseinheit
Einheiten(sonstige)
Qualitative Analyse: KRAS G12C Mutation nachweisbar / nicht nachweisbar
Synonyme
Liquid Biopsy cfDNA KRAS KRAS G12C c.1799T>A c.34G>T ClinGen: CA122528 UniProtKB: P01116#VAR_006839 OMIM: 190070.0001 dbSNP: rs121913530
Analysenfrequenz
wöchentlich
Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage)
aus Vollblut/KM 24h, aus Plasma nicht zutreffend (cfDNA Spezialmonovette erforderlich)
Spezimen
(Plasma, Serum, Harn)
Paxgene/Streck-Plasma Spezialmonovette
Sammelperiode
nicht zutreffend
Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation)
5ml PB/KM, 10ml Paxgene Spezial-Monovette
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe
Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige)
10ml Paxgene Spezial-Monovette (keinesfalls geringeres Volumen!)
Spezielle Präanalytik - Probentransport
EDTA und KM: sofort ins ZIMCL schicken. Plasma: Unbedingt Verwendung von Paxgene/Streck-Spezialmonovette erforderlich, Versand dann bei RT möglich.
Messbereich
KRAS G12C Mutation: nachweisbar/nicht nachweisbar
Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie)
•Heparin als Antikoagulans kann die PCR stören •Unzureichende Qualität und/oder Quantität des Probenmaterials •CAVE: bei zu geringem Probenvolumen bzw. sehr geringer cfDNA Konzentration kann es zu falsch negativen Resultaten kommen. • Für die Liquid Biopsy Diagnostik sind Spezialabnahme-Gefäße (10ml Paxgene Röhrchen) erforderlich
Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch)
nicht zutreffend
Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR
in-house Methode
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