Parameterdetails

Parametername: Molekulares cfDNA Tumor Panel (molek.Tumormarker/Liquid Biopsy)

Version: 1 Gültig ab 22.05.2024

Beschreibung* Nachweis von Mutationen in den häufigsten mit soliden Tumoren assoziierten Genen im Rahmen des molekularen Tumorprofiling (molekulare Tumormarker/Liquid Biopsy) aus Vollblut mittels Next-Generation-Sequencing

Ziel und Zweck der Untersuchung Bei der Diagnostik, Klassifikation und Prognoseabschätzung von soliden Tumoren gewinnt das molekulare Tumorprofiling (auch als molekulare Tumormarker od. Liquid Biopsy bezeichnet) aus im Blutplasma zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA, cfDNA) zunehmend an Bedeutung. Diverse genetische Veränderungen wie z.B. Punktmutationen, Insertionen, Deletionen oder Copy Number Variations sind stark mit der Krankheitsprognose bzw. Therapieansprechen assoziiert.
Demzufolge sieht auch die NCCN-Guideline der soliden Tumore die Liquid Biopsy aus Vollblut als wichtigen Zusatz beim Verlaufsmonitoring, insbesondere bei Patienten, bei denen eine Gewebe-Biopsy nicht möglich oder aussagekräftig ist. Der molekulargenetische Nachweis spezifischer Genveränderungen ist daher von diagnostischer, therapeutischer und letztlich prognostischer Bedeutung.

Der Nachweis von Mutationen aus zirkulierender DNA ist jedoch nicht für die Primärdiagnose von Malignomen (CRC, NSCLC etc) vorhergesehen, sondern dient neben anderen diagnostischen Verfahren als zusätzliche Hilfestellung für Therapieentscheidungen basierend auf dem Mutationsstatus bzw. zur Verlaufskontrolle. Die Bewertung der Ergebnisse ist daher nur in Zusammenschau mit Klinik und anderen histopathologischen Befunden sinnvoll und liegt in der Verantwortung des behandelnden Arztes/Ärztin.

Das im ZIMCL etablierte und validierte Gen-Panel erfasst Punktmutationen (sowie zusätzlich Insertionen/Deletionen, Copy Number Variations oder Fusionen) in folgenden Genen:
ABL1, AKT1, AKT2, ALK (+Fusionen s.u.), APC, AR, ARAF, BRAF (+InDel), BRCA1, BRCA2, CCND1, CCND2, CCND3, CD274, CDK4, CDK6, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, DDR2, DPYD, EGFR (+InDel/CNV), ERBB2 (+InDel/CNV), ESR1, EZH2, FBXW7, FGFR1, FGFR2 (+Fusionen s.u.), FGFR3 (+Fusionen s.u.), FLT1, FLT3, FLT4, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KEAP1, KIT (+InDel), KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET (+InDel/CNV), MLH1, MSH2, MSH6, MTOR, NF2, NFE2L2, NRAS, NTRK1 (+Fusionen s.u.), PDCD1LG2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA (+InDel), PIK3R1, PMS2, PTCH1, PTEN (+InDel), RAF1, RB1, RET (+Fusionen s.u.), RNF43, ROS1 (+Fusionen s.u.), SMAD4, SMO, STK11, TP53 (+InDel), TERT (Promoter), TSC1 (+InDel), TSC2, UGT1A1, VHL.

Erfasste Fusionen:
ALK: Fusionen mit EML4, NPM, NPM1, SLC5A7, RAD51AP2, PRLR, MSH6, CCDC142, ZNF512, HCAR2, AKR1E2, TPM1, TPM3, TPM4, C2orf61, KCNQ5, STRN, GTF2IRD1, DDX6, ATIC, TFG, CARS, CLTC, CLTCL1, DCTN1, SQSTM1, MSN, ALO17, MYH9, KLC1, SEC31A, RANBP2, ASB1, ASB3, HIP1, KCNN3, PNO1, IGKV5, SRD5A2, LBH, MYO7A, RAD51AP2, FAM98A, VCL, FN1, PPFIBP1, RNF213, ALO17, KIAA1618
RET: Fusionen mit CCDC6, ERC1, TRIM33, TRIM27, NCOA4, SPECC1L, FKBP15, TBL1XR1, AKAP13, KIF5B, CUX1, KIAA1468, KTN1, GOLGA5, PRKAR1A, RFG8, PTCH2, NTRK1, RFP, TRIM24, PCM1, HOOK3, PTCH1, RUFY2
ROS1: Fusionen mit SLC34A2, C6orf204, CLTC, EZR, CD74, SDC4, TPM3, LRIG3, EZR, FIG, GOPC, MSN
NTRK1: Fusionen mit TPM3, NFASC, EPHB2, SSBP2, IRF2BP2, TFG, SQSTM1, RET, CD74, ETV6, ARHGEF2, CHTOP, PPL, BCAN, LMNA, MPRIP, NFASC, RABGAP1L, TP53, TPR
FGFR2: Fusionen mit CCDC6, OFD1, KIAA1967, VCL, CCAR2, MGEA5, KIAA1598, CIT, CD44, CASP7, BICC1, AHCYL1, AFF3 FGFR3: Fusionen mit TACC3, FBXO28, AES, JAKMIP1, ETV6, ELAVL3, BAIAP2L1

Da mit dem eingesetzten Verfahren Keimbahn- und somatische Varianten nicht definitiv unterschieden werden können, kann bei klinischer Indikation eine Keimbahnanalyse mit entsprechender Beratung erforderlich sein. Weiters muss ggf. die Möglichkeit von CHIP Mutationen in Betracht gezogen werden und bei entsprechendem Verdacht eine Korrelation mit klinischen/hämatologischen Befunden erfolgen.

Prinzip des Verfahrens Target-Enrichment Next-Generation-Sequencing.

Der Workflow des Verfahrens umfasst vier Schritte:
1. Library Herstellung
Die Sequencing Library erfolgt durch eine zufällige Fragmentierung der eingesetzten DNA, gefolgt von einer 5‘ und 3‘ Adapter Ligation. Die Adapter-ligierten Fragmente werden anschließend amplifiziert und aufgereinigt.

2. Cluster Generation – Hierfür wir die Library auf eine Flow Cell geladen, wo die Fragmente durch Bindung an komplementäre Oligo-Sequenzen gebunden werden. Jedes Fragment wird sodann amplifiziert und bildet durch Bridge-Amplification einen eigenen klonalen Cluster.

3. Sequenzierung: Durch Zugabe von verschieden Fluoreszenz-markierten Nukleotiden kann pro Sequenzierzyklus (entsprechend der verwendeten Leselänge) der Einbau eines bestimmten Nukleotids in jeden DNA Template Strang in Millionen von Clustern parallel optisch anhand der unterschiedlichen Emissionswellenlängen detektiert und in die entsprechende Base übersetzt werden (sog. Sequencing by synthesis).

4. Daten Analyse
Die analysierten Sequenzen werden an die Sequenz des Referenzgenoms angeglichen, wodurch Abweichungen zur Referenzsequenz (SNV, Insertionen, Deletionen, Fusionen etc.) bioinformatisch nachgewiesen werden können. Anschließend erfolgt die medizinische Interpretation der gefundenen Varianten in Zusammenschau mit internationalen Referenz-Datenbanken.

Literatur Baev et al. Liquid Biopsy: Current Status and Future Perspectives. Cancers (Basel). 2023 Jun; 15(12): 3205.
Ettinger et al. NCCN Guidelines Insights: Non–Small Cell Lung Cancer, Version 2.2023. JNCCN Volume 21: Issue 4, DOI: 10.6004/jnccn.2023.0020
Wan et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumor DNA. Nat Rev Cancer; 2017; 4: 223-238
Komatsubara et al. Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy: Current Clinical Applications and Future Directions. Oncology (Williston Park). 2017 Aug 15;31(8):618-27.
Leighl et al. Molecular testing for selection of patients with lung cancer for epidermal growth factor receptor and anaplastic lymphoma kinase tyrosine kinase inhibitorsJ Clin Oncol. 2014 Nov 10;32(32):3673-9.

Ergebniseinheit

Einheiten(sonstige) qualitative Analyse (Mutation nachgewiesen/nicht nachgewiesen)

Synonyme Molekulare Tumormarker
Molekulares Tumorprofiling
Liquid Biopsy
EGFR
BRAF
ALK
ROS1
RET
NTRK1
KRAS
ERRB2
HER2
MET
Gefitinib
Erlotinib
Afatinib
Osimertinib
NSCLC
T790M
L858R
Exon 19 Deletion

Analysenfrequenz ab Erreichen der Mindestprobenanzahl (3 Stk) Workflow-Dauer ~1 Woche

Nachforderungsmöglichkeit der Analyse
(Stunden, Tage) Aus Vollblut nicht möglich. Falls bereits isolierte ctDNA bei -80° gelagert vorhanden ist, 2 Jahre.

Spezimen
(Plasma, Serum, Harn) 10 (!) ml Vollblut (Paxgene oder Streck ccf-Spezial Röhrchen)

Sammelperiode nicht zutreffend

Mindestvolumen pro Anforderung vor Zentrifugation
(vor Zentrifugation) 10 ml Vollblut (Paxgene oder Streck ccf-Spezial Röhrchen)

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe

Abnahmegefäß inkl. Zusatzstoffe(sonstige) 10ml Paxgene/Streck Spezial ccfDNA-Monovette (bitte keinesfalls geringeres Volumen!)

Spezielle Präanalytik - Probentransport INTERN:
Vollständig gefüllte (10ml!) PAXgene oder Streck ccfDNA-Spezialmonovetten erforderlich (im Ausnahmefall tel. im ZIMCL erhältlich). Blut unmittelbar nach Gewinnung mittels ROHRPOST INS ZIMCL einsenden

EXTERN:
Vollständig gefüllte (10ml!) PAXgene/Streck ccfDNA-Spezialmonovetten erforderlich (ggf. im ZIMCL erhältlich). Blut unmittelbar nach Gewinnung bei Raumtemperatur ins ZIMCL versenden.

Messbereich Referenzgenom: GRCh37/hg19

Allgemeine Störungen
(z.B. Lipämie, Hämolyse, Bilirubinämie) - Unzureichendes Probenvolumen
- Unzureichende ctDNA-Konzentration
- Unzureichende ctDNA-Qualität (Degradierung, inadäquate Präanalytik)

Kreuzreaktionen
(z.B. immunologisch) nicht zutreffend

Kennzeichnung des Analyse-Verfahrens nach MPG / IVDR in-house validierter RUO-Assay

Erklärung nach IVDR 2017/746
(für in-house Methoden) ERKLÄRUNG nach Art. 5 (5) der EU-Verordnung über In-vitro-Diagnostika (EU) 2017/746 (IVDR) zur Eigenherstellung eines IVD in Gesundheitseinrichtungen:

Wir erklären in alleiniger Verantwortung, dass das unten angeführte Produkt, welches im Wege der Eigenherstellung von uns hergestellt wird, allen Anforderungen der IVD-Verordnung (EU) 2017/746, Anhang I Grundlegende Sicherheits- und Leistungsanforderungen, entspricht, die anwendbar sind:

Das Produkt wurde in unseren eigenen Räumlichkeiten von uns in nicht industriellem Maßstab gefertigt und wird ausschließlich in unserer Gesundheitseinrichtung betrieben.

Gesundheitseinrichtung: Tirol Kliniken, Anichstr. 35, 6020 Innsbruck
Geschäftsführer: Mag. Stefan Deflorian
Leiter Qualitätsmanagement: Martin Weichselbraun, MSc.

Produktname: Molekulares cfDNA Tumor Panel (molek.Tumormarker/Liquid Biopsy)

Ort und Datum der Erstellung: Innsbruck, am: 03.10.2023

Produktklassifizierung nach Anhang VIII: Klasse: C

Ausdruck gültig am 12.02.2025

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